兰科Orchidaceae植物全球约有700属近20,000种，是被子植物中单子叶演化支内物种最多的草本植物科，被认为是单子叶植物进化的一个高峰。野生种自然分布于热带、亚热带和温带地区，根据生长习性可分为地生、附生和腐生三种类型。兰科植物具有很高的食用、药用、观赏和科研价值。例如，香荚兰属Vanilla Plum. ex Mill.被广泛用于工业(食品和化妆品)原料，香荚兰Vanilla planifolia Andrews是生产优质香草调味料的重要植物。石斛属Dendrobium Sw.、天麻属Gastrodia R. Br.及手参属Gymnadenia R. Br.植物是重要的中药材。兰科植物的花姿和花色优雅，一些野生兰花资源经过深度开发已成为世界级观赏名花，如蝴蝶兰属Phalaenopsis Blume、兜兰属Paphiopedilum Pfitzer、杓兰属Cypripedium L.、独蒜兰属Pleione D. Don、兰属Cymbidium Sw.、万代兰属Vanda Jones ex R. Br.、文心兰属Oncidium Sw.、卡特兰属Cattleya Lindl.、雷丽兰属Laelia Lindl.及石斛属Dendrobium Sw.等。兰科植物的形态奇特、遗传变异较大，在物种形成、进化、传粉生物学、园艺观赏、药用价值和香料利用等方面的研究为人类提供了新认识 [1] - [7] 。

兰花已有2000多年的栽培历史，每年举办兰花世界博览会，促进了兰文化的交流及兰花产业的发展，但中西方的兰花文化存在显著差异。中国长期以来通过筛选兰属野生种或自然突变体用于观赏，小花型、有香味的品种较为经典。常见的国兰有：春兰Cymbidium goeringii (Rchb. f.) Rchb. f.、蕙兰Cymbidium faberi Rolfe、建兰Cymbidium ensifolium (L.) Sw.、寒兰Cymbidium kanran Makino、墨兰Cymbidium sinense Willd.、莲瓣兰Cymbidium tortisepalum Fukuy.、多花兰Cymbidium floribundum Lindl.及碧玉兰Cymbidium lowianum Rchb. f.等。兰花是十大名花(梅花、牡丹花、荷花、兰花、月季花、菊花、杜鹃花、茶花、桂花及水仙)之一。John Dominy于1853年获得首个兰花杂交种后，西方开展了通过人工杂交选育大花型为主的观赏兰花的研究，包括种内杂交、种间杂交及属间杂交。大花蕙兰品系Cymbidium Cultivars是西方的兰花观赏风格的代表类型之一。随着组织培养快速繁殖技术的成熟和普及，常年市场销售的盆栽观赏兰花种类多样。然而，由于过度利用和栖息地破坏等原因，兰科的野生植物变得稀缺或濒临灭绝，已被列入《野生动植物濒危物种国际贸易公约》(The Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora，简称CITES)的保护范围 [1] - [16] 。

兰属植物的研究相对较为深入，全球约70种，分类和观赏价值评价采用的性状包括：花的主色、花瓣(斑点、中部颜色、边缘颜色)、唇瓣(形态、主色、斑点、条纹)、花朵数目、花序、萼片(主色、边缘色、斑点、条纹)、侧萼的外翻程度、花被片的数目、合蕊柱中部的颜色、花序梗的姿态、花序梗的花青甙显色、叶片(数目、形态、叶表面的条纹)、香味以及花期等 [1] - [16] 。

然而，兰属植物的物种分布区及花期的重叠导致了野外类群存在一定程度的自然杂交，长期的驯化育种历史中频繁的人工杂交也导致遗传上中间类型的广泛存在 [13] ；始新世早期以来的季风增强带来有利的水热条件，促进了兰属物种的快速辐射进化 [17] ，形态特征存在一定的种间重叠或相似性，性状的表现也受到生长发育阶段、季节或环境条件的影响，依据表型特征鉴定兰属植物资源多样性存在难度 [1] - [16] 。兰属植物的分类研究经历了形态学、细胞学、孢粉学、化学成分、RAPD、AFLP、ISSR、SSR标记、DNA条形码技术等研究阶段，这些方法信息量较少、分辨能力有限，仍然处于探索阶段 [1] - [17] 。

近年来，随着高通量测序技术的发展，叶绿体全基因组序列数据已经成为植物物种鉴定和系统发生学研究的重要工具 [15] - [32] 。叶绿体基因组因其母系遗传的特性、较高的变异率和丰富的遗传信息，为物种的精细区分提供了强有力的分子标记。与传统方法相比，叶绿体基因组数据显著增加了可用于物种分辨的信息量，从而提高了物种鉴定的准确性和可靠性 [15] - [32] 。本研究在前人工作的基础上，采用了叶绿体基因组大数据和生物信息学分析方法，进一步探索了叶绿体全基因组序列数据在兰属植物物种鉴定中的潜力，我们识别出了大量物种特异性的变异位点，这些变异位点在物种间的区分上显示出了高度的分辨能力。此外，我们还构建了基于叶绿体基因组数据的系统发生树，清晰地揭示了兰属植物之间的亲缘关系。这些结果不仅验证了叶绿体基因组数据在物种鉴定中的有效性，也为理解兰属植物的进化历史和生物地理模式提供了新的视角。为了促进兰属植物资源的保护和可持续利用，我们提出了一种基于叶绿体全基因组序列数据的分子鉴定新方法。该方法通过精确识别物种特异性的遗传标记，为兰属植物的分类和保护提供了更为科学和精确的依据。我们相信，这一方法的应用将极大地推动兰属植物研究的进展，并为其他植物类群的物种鉴定提供参考。

选取8份样品代表兰属的3个种，每种取样2~3个体。供试样品名称及其叶绿体基因组的序列号如 表1 ( https://www.ncbi.nlm.nih.gov )。根据本团队研发的方法 [24] - [32] 编制分子分类检索表。利用MAFFTv7.055b软件 [33] ( http://mafft.cbrc.jp/alignment/software )获得比对序列矩阵。比对后的序列矩阵的长度为158,740个核苷酸，由左向右，左端(5’-端)起的第1个核苷酸字母的位置编号为1，最右端的核苷酸字母的位置编号为158,740。用MEGA 7.0 [34] 和DnaSP v6软件 [35] ( http://www.ub.edu/dnasp/ )检测核苷酸变异位点( 图1 ， 表2 )。每个物种的特有核苷酸变异位点作为分子分类性状，用于编写兰属供试样品的分子分类检索表(见 图1 )。选择兰科石斛属的铁皮石斛Dendrobium officinale以及蝴蝶兰属的华西蝴蝶兰Phalaenopsis wilsonii Rolfe和小尖囊蝴蝶兰Phalaenopsis taenialis (Lindl.) Christenson & Pradhan (syn. Phalaenopsis braceana (Hook. f.) Christenson)为外类群( 表1 和 图2 )。用MEGA 7.0软件的Tamura 3-parameter model参数模型推断系统发生关系( 图2 )。

注：*外类群。

图1. 基于叶绿体基因组的物种特有核苷酸变异位点的兰属(兰科) 3个种的分子分类检索表

注：*该列的序号与检索表内的序号对应；1a为莲瓣兰，2a为秋墨兰，3a为西藏虎头兰。**核苷酸变异位点数(在4种碱基中的占比)；***此列括号中，前一个数字是在物种特有变异位点总数(1285)中所占的比例；后一个数字是在全部核苷酸变异位点总数(1375)中所占的比例。

兰属供试样品的叶绿体基因组的长度为150,162 (MW582690.1，莲瓣兰Cymbidium tortisepalum Fukuy.)~156,629 (ON969306.1，西藏虎头兰C. tracyanum L. Castle)个核苷酸。在比对序列中，共检测到1375个核苷酸变异位点，占叶绿体基因组序列全长的约0.92%。其中，各物种的特有核苷酸变异位点数目合计为1285个核苷酸，占变异位点总数的93.45%。西藏虎头兰Cymbidium tracyanum (1185)的特有变异位点的数量最多，分别是秋墨兰Cymbidium haematodes Lindl.(53)和莲瓣兰Cymbidium tortisepalum (47)的特有变异位点数量的22倍和25倍。西藏虎头兰的特有变异位点中，A (31.39%)或T (30.97%)的比例明显高于C (20.08%)或G (17.55%)。莲瓣兰的特有变异位点中，A (21.28%)的比例略低于T (25.53%)、C (27.66%)或G (25.53%)的比例，T、C或G的比例差异小。秋墨兰的特有变异位点中，C (32.08%)的比例明显高于T (18.87%)的比例，A (26.42%)和G (22.64%)的比例间于C的比例与T的比例之间，差异不大( 表2 )。特有变异位点的数量和核苷酸构成存在种间差异。利用特有核苷酸变异位点，编制分子分类检索表，供试样品得到精准鉴定( 图1 和 图2 )。

中国数字植物标本库( http://www.cvh.ac.cn/ )的数据显示，中国兰属标本的最早采集日期记录是1904年，经过120多年的积累，来自国内外的兰属植物标本数量共计3198份，57个种/变种，占全球兰属物种总数(70)的约81.43%，包括形态特征图片和文字描述( 表3 )。存在同名异物和同物异名现象，例如，Cymbidium pendulum Sw.和Cymbidium simulans Rolfe为纹瓣兰Cymbidium aloifolium (L.) Sw.的异名；Cymbidium bicolor Subsp. obtusum Du Puy& P.J. Cribb和Cymbidium mannii Rchb. f.为硬叶兰Cymbidium crassifolium Wall.的异名；Cymbidium szechuanicum Y.S. Wu & S.C. Chen为Cymbidium cyperifolium var. szechuanicum (Y.S. Wu & S.C. Chen) S.C. Chen & Z.J. Liu的异名；Cymbidium simonsianum King & Pantl.为冬凤兰Cymbidium dayanum Rchb. f.的异名；Cymbidium densiflorum Griff.和Cymbidium longifolium D. Don为莎草兰Cymbidium elegans var. elegans的异名；Cymbidium ensifolium var. Susin T. C. Yen、Cymbidium ensifolium var. susin f. arcuatum、Cymbidium ensifolium var. susin f. falcatum、Cymbidium ensifolium var. susin f. arcuatum、Cymbidium misericors var. oreophilum Hayata及Cymbidium rubrigemmum Hayata为建兰Cymbidium ensifolium (L.) Sw.的异名；Cymbidium floribundum var. pumilum (Rolfe) Y.S. Wu & S.C. Chen为多花兰Cymbidium floribundum Lindl.的异名；Cymbidium forrestii Rolfe、Cymbidium yunnanense Schltr.、Cymbidium virens Rchb.f.及Cymbidium virescens Lindl.为春兰Cymbidium goeringii (Rchb. f.) Rchb. f.的异名；Cymbidium sundaicum Schltr.和Cymbidium siamense Rolfe ex Downie为秋墨兰Cymbidium haematodes Lindl.的异名；Cymbidium grandiflorum Griff.为虎头兰Cymbidium hookerianum Rchb.f.的异名；Cymbidium purpureohiemale Hayata为寒兰Cymbidium kanran Makino的异名；Cymbidium javanicum Blume和Cymbidium multiradicatum Z. J. Liu & S. C. Chen为兔耳兰Cymbidium lancifolium Hook.的异名；Cymbidium goeringii var. longibracteatum (Y.S. Wu & S.C. Chen) Y.S. Wu & S.C. Chen为春剑Cymbidium tortisepalum var. longibracteatum (Y.S. Wu & S.C. Chen) S.C. Chen & Z.J. Liu的异名；Cymbidium hookerianum var. lowianum (Rchb. f.) Y.S. Wu & S.C. Chen为多根兰Cymbidium lowianum Rchb. f.的异名；马关兰Cymbidium maguanense F. Y. Liu为大雪山Cymbidium mastersii Griff. ex Lindl.的异名；Cymbidium goeringii var. serratum (Schltr.) Y. S. Wu & S. C. Chen为线叶春兰Cymbidium serratum Schltr.的异名；Cymbidium sinense var. album T. C. Yen、Cymbidium sinense var. album f. Viride-Florum及Cymbidium sinense var. margicoloratum Hayata是墨兰Cymbidium sinense Willd.的异名。有些名称实际上是兰科其它属的物种的异名，例如，Cymbidium aphyllum (Roxb.) Sw.为兰科石斛属的兜唇石斛Dendrobium aphyllum C. E. C. Fisch.的异名；Cymbidium giganteum Sw.为兰科美冠兰属Eulophia R. Br.的紫花美冠兰Eulophia speciosa bolus的异名；紫点杓兰Cymbidium guttatum (L.) Willd.为兰科托伦兰属Tolumnia Raf.的Tolumnia guttata (L.) Nir的异名( https://tnrs.biendata.org/ 及 https://powo.science.kew.org/ )。约55%的兰属植物标本的采集日期为50年以前。兰属植物标本的92个名称中，异名(35个)占38.04%。馆藏标本份数最多的是多花兰Cymbidium floribundum (550)、春兰Cymbidium goeringii (362)、建兰Cymbidium ensifolium (347)、兔耳兰Cymbidium lancifolium (274)、蕙兰Cymbidium faberi (226)以及寒兰Cymbidium kanran (218)。大于3份(含)标本的有33个物种，小于3份标本的有24个物种。目前的馆藏标本材料不足以支持全面研究兰属物种的分子鉴定和系统发生关系。

兰属植物主要分布于热带的印缅区和巽他区两大生物多样性热点地区，包括东亚–东南亚地区的近20个国家 [17] [36] [37] ，但生物多样性调查和采集较为薄弱，基础数据尚有较多的空缺。对21国40个植物标本馆的4500份标本的取样调查结果显示，50%以上的热带植物标本存在名称鉴定错误 [38] 。长期以来，由于物种数量较多、分布地域较广，不同季节和生长发育阶段，同一株植物的外观形态特征可能有不同的表现，研究者在有限的项目实施期间内难以做到面面俱到的深度调查。即使是一个属的植物研究，也存在熟悉不同野生种或栽培品种的专家，知识面、经验、技能和认识理解深度各异。人类的整体科学认识是由众多专家的个人认识积累拼在一起形成的。这些原因导致了同物异名和同名异物的产生以及文献中研究成果价值大小或科技进步跨度大小的差异。围绕一个主题只有涉及到的内容才能在一篇严谨的论文中刊登发表，每一位研究者大量零散的深度观察、经验以及分析的阶段性结果没有被公布于世。各研究机构都有自己对研究内容的侧重点要求和研究进度的管控和评价方式，学术交流距离充分交流有较大距离，也是研究进展缓慢的原因之一。利用名称鉴定可靠的标本和活植物建立兰属全部物种的分子分类检索表，有助于资源保护和利用，工作量巨大，需要开展国际协作 [39] [40] 。

本研究成功开发了一种基于叶绿体基因组变异位点的兰属植物分子鉴定新方法，为兰属植物的分类修订、种质资源的保护和利用提供了重要的分子工具。经历120多年的标本采集，中国标本馆系统尚未完成对兰属植物的全球全部物种的标本收集馆藏。我们的研究结果强调了国际合作在建立全属物种分子检索表中的重要性，并建议加强数据共享，以促进全球范围内的兰属植物研究。未来工作应考虑扩大样本范围，进一步验证该方法的普适性及在其他植物类群中的应用潜力。建议制定相应的保护政策，确保兰属植物资源的可持续利用。本文报道的新方法从叶绿体基因组序列大数据中提取可用于物种分类的关键特征数据，在利用人工智能管理和利用全球植物资源多样性方面可达到清洗数据、节省算力、提高运算速度的目的。

本研究得到天津市人力资源和社会保障局、天津市人力资源建设服务中心、山东省人力资源和社会保障厅、鲁东大学、上海市人力资源和社会保障局、上海计算技术培训中心、上海海洋大学以及国家专业技术人才知识更新工程项目的大力支持。卢思聪、罗毅波、陈学达、袁国华、方爱国、严志宏、崔正及杨智慧等专家给予了热情的讨论。本调查得到国家植物标本资源库(National Plant Specimen Resource Center)平台的支持。

^*通讯作者。