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医药卫生

水母胶原联合SOD对骨质疏松症模型小鼠的干预作用
The Interventional Effect of Jellyfish Collagen Combined with SOD on a Mice Model of Osteoporosis

刘

倩

¹ 陈

永

² 唐中生

³ 徐

蕾

⁴ 阮仁全

⁵

贵州中医药大学基础医学院，贵州贵阳

遵义医科大学附属医院风湿免疫科，贵州遵义

贵州中医药大学解剖学教研室，贵州贵阳

美尔健(深圳)生物科技有限公司研发部，广东深圳

美尔健(深圳)生物科技有限公司总经理办公室，广东深圳

05 07 2024

13 04 341 347 4 6 ：2024 8 6 ：2024 8 7 ：2024

2024

This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

目的：观察水母胶原联合超氧化物歧化酶(JCSOD)对糖皮质激素诱导的骨质疏松症模型小鼠的干预作用。方法：将C57BL/6小鼠分为正常对照组(NC)、模型组(Dex)、JCSOD低剂量组(JCSOD-L)、JCSOD高剂量组(JCSOD-H)、水母胶原组(JC)、氨糖软骨素钙片组(ACc)，每组5只。干预60天，结束后采集骨组织和血清，分别进行病理组织学和骨胶原纤维形态学检测，采用酶联免疫吸附法(ELISA)进行骨特异性碱性磷酸酶(BALP)和活性氧(ROS)含量检测。结果：病理组织学检测和骨胶原纤维形态学检测提示，与Dex组相比，JCSOD-H组和JC组显著维持了骨小梁的构架，提高了骨胶原的着色深度和纹理的清晰度，JCSOD-L组和ACc组效果较差，但效果优于Dex组。ELISA法检测显示，与Dex组相比，JCSOD低、高剂量组、JC组和ACc组都显著提高了血清BALP的含量(P < 0.005)，降低了骨组织ROS的含量(P < 0.005)。结论：JCSOD可以通过保持骨小梁的架构、提高骨胶原纤维的染色深度、增加BALP的表达和减少ROS的含量来减缓激素诱导的骨质疏松症小鼠的病情进展。
Objective: To observe the intervention effect of jellyfish collagen combined with superoxide dismutase (JCSOD) on glucocorticoid-induced osteoporosis model mice. Methods: C57BL/6 mice were divided into normal control group (NC), model group (Dex), JCSOD low-dose group (JCSOD-L), JCSOD high-dose group (JCSOD-H), jellyfish collagen group (JC) and aminosaccharide chondroitin calcium tablet group (ACc), with 5 mice in each group. After 60 days of intervention, bone tissue and serum were collected, and histopathological and bone fibrillar morphology were detected, respectively. Bone-specific alkaline phosphatase (BALP) and reactive oxygen species (ROS) contents were detected by enzyme-related immunosorbent assay (ELISA). Results: Compared with Dex group, JCSOD-H and JC groups significantly maintained bone trabecular structure and improved the depth of collagen staining and texture clarity. JCSOD-L and ACc groups had worse effects, but had better effects than Dex group. ELISA assay showed that compared with Dex group, JCSOD low, high dose, JC and ACc groups significantly increased serum BALP content (P < 0.005), and decreased bone tissue ROS content (P < 0.005). Conclusion: JCSOD can slow down the progression of steroid-induced osteoporosis in mice by maintaining the structure of bone trabeculae, increasing the staining depth of bone fibrils, increasing the expression of BALP and decreasing the content of ROS.

骨质疏松症，糖皮质激素，水母胶原，骨特异性碱性磷酸酶，活性氧
Osteoporosis
Glucocorticoid Jellyfish Collagen Bone Specific Alkaline Phosphatase Active Oxygen

1. 引言

骨质疏松症(Osteoporosis, OP)是一种由多种原因导致的骨密度和骨质量下降，骨微结构破坏，造成骨脆性增加，从而容易发生骨折的全身性骨病 [1] 。糖皮质激素(Glucocorticoid, GC)的大量使用是导致继发性骨质疏松症的重要原因之一。现有研究证实，骨吸收与骨形成失衡是导致OP的主要病理机制 [2] 。双磷酸盐是治疗糖皮质性骨质疏松症的常规用药，可有效抑制骨吸收，但其对骨吸收形成抑制，同时也会对骨正常矿物化造成影响，增加类骨质，加大骨折风险 [3] 。

构成骨胶原纤维的蛋白质为Ⅰ型胶原蛋白 [4] 。仇雷雷等的研究表明，水母胶原蛋白(Jellyfish collagen, JC)与牛Ⅰ型胶原蛋白相似，符合Ⅰ型胶原蛋白特征 [5] 。胶原纤维在骨组织中起到结构性的网架作用，纤维的排列方向有一定规律，对于压力有一定的抵抗作用，由于胶原纤维的存在，使骨的硬度加强。胶原蛋白外用能清除体内自由基，起到多方面抗氧化的作用。超氧化物歧化酶(Super oxide dismutase, SOD)是一种重要的抗氧化酶，可以防止氧化应激引起的细胞损伤 [6] 。氧化应激是引起OP的重要危险因素 [7] ，或许可以通过内服水母胶原联合超氧化物歧化酶(Jellyfish collagen and super oxide dismutase, JCSOD)降低氧化应激的方式改善OP。

本实验采用JCSOD内服的方法，通过病理组织学和骨胶原纤维形态学检测，分析各组小鼠体内ROS和骨特异性碱性磷酸酶(Bone specific alkaline phosphatase, BALP)的含量，探讨JCSOD对OP的可能机制，为日常防治OP提供基础实验依据。

2. 材料和方法 2.1. 实验动物

选取雌性3月龄SPF级C57BL/6小鼠30只，体质量为(20 ± 2) g。实验动物使用许可证号：SCXK (粤) 2022~0002。质量检测单位为广东省医学实验动物中心。通过了贵州中医药大学动物伦理审查会审查，编号为2024018。

2.2. 药品试剂及器材

水母胶原蛋白冻干粉(美尔健生物技术有限公司)，深海超氧化物歧化酶SOD (中科欣扬生物科技有限公司)，地塞米松磷酸钠注射液，生理盐水，蒸馏水，小鼠BALP的ELISA检测试剂盒，小鼠ROS的ELISA检测试剂盒，酶标仪(450 nm)，高精度加样器及枪头，37℃恒温箱，苏木精–伊红染色法(HE)试剂盒、Masson三色染色试剂盒(Solarbio)，正置显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司)，石蜡切片机(苏州工业园区汇光科技有限公司)，摊片烤片机(湖北康强医疗器械有限公司)，生物组织包埋机–冷冻机、生物组织包埋机(孝感奥华医疗科技有限公司)，自动组织脱水机(湖北康强医疗器械有限公司)，无菌PBS缓冲液。

2.3. 实验方法

雌性3月龄SPF级C57BL/6小鼠30只，随机分为6组，空白对照组(Normalcontrol, NC)、模型组(Dexamethasone, Dex)、JCSOD低剂量组(JCSOD-L)、JCSOD高剂量组(JCSOD-H)、水母胶原组(JC)、氨糖软骨素钙片组(Amino sugar chondroitin calcium tablets, ACc)，每组5只。其中JCSOD-L、JCSOD-H、JC、ACc为药物组。NC组腹腔注射生理盐水0.02 mL/d，蒸馏水灌胃0.05 mL/d。Dex组及药物组腹腔注射地塞米松造模2 mg/kg/d [8] 。药物组分别以JCSOD (200 mg/kg/d)、JCSOD (400 mg/kg/d)、JC (200 mg/kg/d)、Acc (70 mg/kg/d)灌胃。以上干预方法在同一天进行，持续60天。

造模与灌胃结束后，断食断水12 h，于小鼠眼球静脉丛取血，充分取血后，迅速分离出小鼠双侧股骨和胫骨，剔除骨组织周围肌肉结缔组织。将胫骨样本放于−80℃冰箱冻存。

双侧股骨经过48小时的4%多聚甲醛溶液固定处理后，进行4周的EDTA脱钙，以大头针可轻易刺入骨组织为标准判断脱钙是否完成，脱钙成功后将双侧股骨放入包埋盒中，流水冲洗24 h后，进行脱水、透明、浸蜡操作，取出组织，包埋。

将已经包埋的股骨组织样本存放于−20℃的冷冻环境中，以便达到适宜的硬度切片。切片的厚度控制在3 μm。随后进行包埋、水浴展片、捞片的步骤，将切片平铺并粘贴于载玻片上。控片、展片，迅速进行烤片处理。烤干后，需放置于载片架上，随后置于40℃的恒温箱中1 h，以备后续使用。

充分采血完成后，静置30 min，离心(转速2500 G，时间为15 min)，吸取上层血清转移至1.5 mL清洁EP管中，放置于−80℃冰箱冻存备用。

2.4. 检测指标及方法

经过常规的脱蜡至水的左侧股骨组织切片，稍水洗，采用苏木精液进行染色。使用1%盐酸酒精进行处理，再次水洗后，利用促蓝液进行返蓝处理，流水冲洗去除多余染色剂。之后，切片被0.5%伊红溶液染色，用蒸馏水洗涤，并通过梯度乙醇脱水，最后用二甲苯透明处理。封固步骤中，采用中性树胶。最后，利用显微镜对处理后的切片进行拍照记录。

将右侧股骨组织切片脱蜡至水，染色，分化、水洗，返蓝、水洗。染色、洗涤，梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。显微镜拍照，使用图像采集系统采集相关部位图像。

组织匀浆，将双侧胫骨组织加入适量生理盐水捣碎，离心(转速3000 G，10分钟)，取上清，冻存于−20℃冰箱。检测前，分别将血清样本和胫骨匀浆液从冰箱取出，在室温下充分解冻。从室温平衡20 min后的铝箔袋中取出所需板条。设置标准品孔和样本孔，分别按照试剂盒说明进行操作。在450 nm波长处测定各孔的OD值。

实验数据采用SPSS 26和GraphPad prism 9软件分析，多组间比较采用单因素方差分析，以均值 ± 标准差( $\bar{x} \pm s$ )表示，P < 0.05表示差异具有统计学意义。

3. 结果 3.1. JCSOD对各组小鼠骨组织形态的影响 Figure 1 注：骨小梁被染为浅红色，骨髓组织呈红褐色或深蓝色。--Figure 1. HE staining of bone trabecula in epiphysis of mice in each group--

HE染色骨骺端显微镜拍照，结果显示：NC组，骨小梁致密，排列整齐，连接紧密；Dex组，骨小梁稀疏，变薄，有断裂，排列不规律；JCSOD-L组，骨小梁稀疏，排列不规律；JCSOD-H组，骨小梁较粗，骨小梁较为致密，但低于JC组；JC组，骨小梁明显增粗，致密整齐；ACc组，骨小梁稀疏，排列不规律。见图1 。

3.2. JCSOD对各组小鼠骨胶原的影响

Masson染色结果显示：NC组，骨胶原着色深，纹理清晰，排列规律，无断裂；Dex组，骨胶原着色最浅，纹理不清晰，排列不规律，模糊成片；JCSOD-L组，骨胶原着色较浅，纹理不清晰，排列不规律；JCSOD-H组，骨胶原着色深，纹理清晰，但稍逊于JC组，排列规律，较少断裂；JC组，骨胶原着色深，纹理清晰，排列规律，较少断裂；ACc组，骨胶原着色深，排列较规律，较少断裂。见图2 。

Figure 2 注：细胞核呈蓝灰色，胞浆、肌肉、红细胞呈红色，胶原纤维蛋白呈蓝色。--Figure 2. Masson staining of bone collagen in each group-- 3.3. JCSOD对各组小鼠血清BALP的影响

Dex组BALP含量明显低于其余各组(P < 0.05)，而药物组含量均高于NC组(P < 0.05)。JC组含量低于其余药物组。ACc组与JCSOD-H组含量相似但低于JCSOD-L组。见表1 BALP (单位：ng/ml)。

Table 1 <xref></xref>Table 1. Comparison of serum BALP and ROS content in bone tissue of mice in each group (mean ± standard deviation)Table 1. Comparison of serum BALP and ROS content in bone tissue of mice in each group (mean ± standard deviation) 表1. 各组小鼠血清BALP、骨组织ROS含量的比较(均值 ± 标准差)

组别	n	BALP (单位：ng/ml)	ROS (单位：pg/g)
NC组	5	9.78 ± 0.69^*	9036.82 ± 414.17^*#
Dex组	5	7.84 ± 0.51	9732.3 ± 421.35
JCSOD-L组	5	14.07 ± 0.44^*#	6529.05 ± 463.24^*#
JCSOD-H组	5	13.1 ± 0.74^*#	7314.2 ± 411.15^*#
JC组	5	11.52 ± 1.02^*#	7763.49 ± 394.97^*#
ACc组	5	13.09 ± 0.59^*#	7290.21 ± 400.26^*#

注：^*与Dex组比较，P < 0.05；^#与NC组比，P < 0.05。

3.4. JCSOD对各组小鼠骨组织ROS的影响

Dex组ROS表达明显高于其余各组(P < 0.05)，而药物组表达均低于NC组(P < 0.05)。JCSOD-L组表达最低，JC组表达均高于其余药物组。见表1 ROS (单位：pg/g)。

4. 讨论

糖皮质激素(Glucocorticoid, GC)所致的骨质疏松症是继发性骨质疏松症的常见原因，发生率仅次于老年性骨质疏松症和绝经后骨质疏松症 [9] 。GC会抑制成骨细胞因子的产生，如胰岛素样生长因子I和骨的主要有机成分，即I型胶原蛋白；还会直接作用于成熟的破骨细胞，从而抑制其凋亡 [10] 。因此，骨形成被迅速地抑制，骨吸收大于骨形成。骨骼的生理状态下，其生长依赖于正常骨代谢，在骨形成阶段，骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞，随即分泌出胶原纤维，新生成的胶原纤维和其他结构蛋白逐渐沉积形成骨基质，在适当的条件下，钙离子和磷酸盐会沉积在胶原纤维之间，形成矿化结晶，进而形成硬质骨组织。同时破骨细胞也同样被激活，分泌出相关酶原，使周围死骨被溶解，溶解过程中成骨细胞又迁移至此处，进一步形成新骨，以此维持动态平衡 [11] [12] 。

在骨基质中，胶原纤维起着支撑和结构性作用，使骨骼具有弹性和韧性。同时，无机盐类物质如羟基磷灰石等沉积在胶原纤维之间，形成矿化结构，增加了骨骼的硬度和抗压强度 [13] 。水母胶原具有促进骨细胞增殖和分化、促进骨细胞基质生成、提高骨组织生物相容性等优点。既往研究显示，将水母胶原应用于骨修复领域，可以促进骨细胞的黏附和增殖，有助于促进骨细胞的再生和骨组织的修复 [14] 。此外，水母胶原还可以模拟骨基质的微环境，提供细胞黏附的支撑，有利于骨细胞的定向生长和分化 [15] 。因此，水母胶原作为一种生物相容性良好的材料，在骨修复和骨再生领域具有广阔的应用前景。在骨细胞中，SOD有助于维持细胞内的氧化还原平衡，保护骨细胞免受氧化应激的影响 [16] 。SOD与骨密度呈正相关，在减少骨组织中的氧化损伤的同时，有助于维持骨密度和骨质的稳定性 [17] 。本实验使用内服JCSOD的方法，对进展中的骨质疏松症干预后，骨小梁排列整齐，胶原纤维纹理清晰，排列规律，HE染色和Masson染色均显示效果良好。

BALP的主要作用是水解磷酸酯键，从而促进骨骼中磷酸盐的沉积和矿化，有助于骨骼的形成和维持 [18] 。它作为一种骨细胞特异性标志物，主要存在于成熟骨细胞和成骨细胞表面，其含量表达水平可以反映成骨细胞的活性和骨形成情况 [19] [20] 。BALP表达水平的下降可能反映了骨细胞活性的降低和骨形成的减少，进而导致骨密度下降和骨质疏松症的发展。BALP水平与骨密度之间呈正相关，较高的BALP水平通常伴随较高的骨密度，这表明BALP的变化可以在一定程度上反映骨质状态 [21] 。本实验中JCSOD的干预使GC诱导的骨质疏松症小鼠血清中BALP的含量明显升高，提示JCSOD可以有效促进骨形成，从而减缓激素诱导的骨质疏松症小鼠的病情进展。

ROS是一种由氧气分子通过还原反应生成的自由基。这些自由基在细胞代谢和生物化学反应中产生，在正常生理状态下保持相对平衡，在过量积累时就会引起氧化应激 [22] 。骨髓间充质干细胞成骨分化障碍的原因之一就是ROS诱导线粒体损伤造成的 [23] 。研究显示，ROS抑制成骨细胞的增殖分化，刺激成骨细胞和骨髓基质细胞的RANKL表达，促进破骨细胞形成和分化，对骨质疏松的发生起着重要促进作用 [24] 。本实验在JCSOD药物干预后小鼠骨组织ROS表达量显著降低，提示JCSOD可通过降低氧化应激程度，减缓骨质疏松症的发展。

综上所述，JCSOD在防治激素诱导的骨质疏松症方面，能有效延控骨质疏松症的发病进程，维持骨小梁的组织架构，提高骨胶原纤维的染色深度，升高BALP骨代谢指标，抑制ROS的活性。治疗过程中未有小鼠发生意外死亡，说明口服JCSOD具有较高的安全性。不足之处在于本次实验检测指标和检测方法较少，缺乏其他相关指标的验证，不能从多方面论证JCSOD对骨质疏松症的作用。

NOTES

^*第一作者。

^#通讯作者。

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