从蛋白质结构数据库 (Protein data bank, PDB) [14] 中下载MOR的晶体结构(PDB ID: 7UL4)，其分辨率为2.8 Å。将受体的三维结构抽象为一个弹性网络，每个氨基酸简化为网络中的一个节点(通常用Cα原子表示)，若节点间的距离小于某一特定的截断半径，则用力常数统一的弹簧进行连接，整个体系的总势能为 ：

$V=\frac{1}{2}\gamma \left[\Delta R^{\text{T}}H\Delta R\right]$ (1)

其中，γ是弹簧的力常数， $\Delta R={\left[\Delta X_{\text{1}},\Delta Y_{\text{1}},\Delta Z_{\text{1}},\Delta X_{\text{2}},\Delta Y_{\text{2}},\Delta Z_{\text{2}},\cdots ,\Delta X_N,\Delta Y_N,\Delta Z_N\right]}^{\text{T}}$，N为残基数，上标T表示向量的转置，H表示3N × 3N的海森矩阵，其元素为：

$H=\left[\begin{array}{cccc}{H}_{11}& H_{12}& \cdots & H_{1N}\\ H_{21}& H_{22}& \cdots & H_{2N}\\ ⋮& ⋮& \ddots & ⋮\\ H_{N1}& H_{N2}& \cdots & H_{NN}\end{array}\right]$ (2)

当 $i\ne j$时，子矩阵H_ij为：

$H_{ij}=\left\{\begin{array}{l}\frac{{\partial }^{2}V}{\partial X_i\partial X_j}\frac{{\partial }^{2}V}{\partial X_i\partial Y_j}\frac{{\partial }^{2}V}{\partial X_i\partial Z_j}\\ \frac{{\partial }^{2}V}{\partial Y_i\partial X_j}\frac{{\partial }^{2}V}{\partial Y_i\partial Y_j}\frac{{\partial }^{2}V}{\partial Y_i\partial Z_j}\\ \frac{{\partial }^{2}V}{\partial Z_i\partial X_j}\frac{{\partial }^{2}V}{\partial Z_i\partial Y_j}\frac{{\partial }^{2}V}{\partial Z_i\partial Z_j}\end{array}\right\}$ (3)

当 $i=j$时，子矩阵H_ii为：

$H_{ii}=-{\displaystyle \underset{i\ne j}{\sum }{H}_{ij}}$ (4)

海森矩阵分解得到的特征向量表示蛋白质的运动模式，残基的均方涨落(mean square fluctuations, MSF)和残基间的交叉相关涨落(correlated fluctuation, CoF)为：

$\langle \Delta R_i\cdot \Delta R_i\rangle =\frac{k_{B}T}{\gamma }\left(H_{3i-2,3i-2}^{-1}+H_{3i-1,3i-1}^{-1}+H_{3i,3i}^{-1}\right)$ (5)

$\langle \Delta R_i\cdot \Delta R_j\rangle =\frac{k_{B}T}{\gamma }\left(H_{3i-2,3j-2}^{-1}+H_{3i-1,3j-1}^{-1}+H_{3i,3j}^{-1}\right)$ (6)

其中，k_B是Boltzmann常数，T为绝对温度。归一化的运动交叉相关性为：

$C_{ij}=\frac{\langle \Delta R_i\cdot \Delta R_j\rangle }{\sqrt{\langle {\left(\Delta R_i\right)}^2\rangle \cdot \langle {\left(\Delta R_j\right)}^2\rangle }}$ (7)

C_ij的取值范围在[−1, 1]之间，其中正值表示残基间的运动方向相同，而负值则表示运动方向相反。C_ij的绝对值越大，意味着残基间的运动相关性越强。

蛋白质的结构和功能依赖于氨基酸残基之间复杂的相互作用网络。在加权的复杂网络模型 [12] 中，用残基中的Cα原子代表网络中的节点，截断半径内的节点用边连接，边权重基于ANM得到的残基间的运动相关性计算得出：

$w_{ij}=-\log \left(\left|C_{ij}\right|\right)$ (8)

特征路径长度(Characteristic Path Length, CPL)是网络中所有节点对之间最短路径的平均长度：

$CPL=\frac{1}{N_p}{\displaystyle \underset{j>i}{\overset{N}{\sum }}{d}_{ij}}$ (9)

其中N和N_p分别是节点数和节点对数，d_{i j}表示从节点i到j累计边权重最小的路径长度。节点k对网络内信息通信的贡献是通过从网络中移除节点k后CPL的变化(ΔCPL_k)来衡量 [15] ，用Z-score表示：

$Z{\text{-score}}_k=\frac{\Delta CP{L}_k-\langle \Delta CP{L}_k\rangle }{\sigma }$ (10)

其中，ΔCPL_k是移除节点k后特征路径长度的变化， $\langle \Delta CPL\rangle$是依次移除各节点后特征路径长度变化的平均值，σ是标准差。

温度因子(B-factor)可以体现分子的局部柔性。对MOR构建模型时，通过最大化理论B-factor和实验之间的皮尔森相关系数(Pearson correlation coefficient, PCC) [16] 来优化ANM中的截断半径，其寻优范围是：6.0~30.0 Å，步长为1.0 Å。当r_c = 23.0 Å时，理论B-factor和实验的PCC值达到最大，为0.79 ( 图2 )。ANM可以较好地模拟MOR中各结构域的波动。TM区域的涨落幅度较小，而ECLs和ICLs区域的涨落则更为明显，符合跨膜结构的特点。另外，实验发现ECLs负责多种配体的识别，ICLs可以与G蛋白等效应蛋白相互作用，这些区域的柔性变化在信号转导中至关重要 [17] [18] 。

慢运动模式通常代表与蛋白功能相关的大幅度集合运动， 图3 显示了在第一慢运动模式下MOR中各残基的涨落。峰值对应重要的功能区域——ECL2和ICL3，ECL2的β发夹结构在配体结合时会出现轻微的移动，该区域残基的突变对配体结合和受体激活有不利影响 [19] ；ICL3通过阻断或暴露G蛋白结合位点的动态构象平衡来调节受体活性 [20] 。MOR中涨落较小的区域同样具有特定的功能，第1个区域中的I77^1.41和V80^1.44以及第2个区域中的P122^2.58参与构成MOR的二聚体界面；位于TM3的第3个区域包含保守的DRY基序[Asp164^3.49-Arg165^3.50-Tyr166^3.51]，基序中的局部螺旋内接触以及和T279^6.34之间的极性相互作用在阿片受体中普遍存在，研究表明消除残基间的极性相互作用会使受体具有组成性活性 [21] 。

在快运动模式下，表现出较大运动幅度的残基往往被视为动力学上的热点残基，这些残基在稳定蛋白质空间结构中起着至关重要的作用 [22] 。 图4 中显示了5个涨落峰值，对应的残基分别是：D114^2.50、S154^3.39、L158^3.43、V282^6.37和S329^7.46。其中，D114^2.50、S154^3.39、S329^7.46和N150^3.35、N328^7.45组成钠离子结合位点，并且形成广泛的极性相互作用网络，钠离子结合到该位点，通过变构效应可以稳定受体的非活性构象。将D114^2.50位点上的带电残基替换为不带电残基后，一些GPCRs的激动剂依赖性信号传导能力会显著下降，而配体结合能力和基础信号传导水平则得以保持，揭示了该位点在激动剂引起的GPCR信号传递过程中的特定作用 [23] 。保守的疏水残基L158^3.43和V286^6.41组成疏水锁，其闭合会压缩TM6和TM3的堆积，有利于TM6细胞内端的向内移动，这是GPCR失活所必需的 [24] 。V282^6.37可以与G蛋白的Gα亚基上的保守残基相互作用，在MOR激活过程中，胞质侧偶联区域残基的构象变化会提高受体对激动剂的结合亲和力 [25] 。

为研究MOR中残基之间的功能性运动耦合，基于公式(7)计算了残基涨落之间的动态互相关矩阵 (Dynamic cross-correlation matrix, DCCM)， 图5 是前208个低频运动模式(对残基涨落贡献大于50%)获得的结果。涨落之间的交叉相关性能够提供与空间运动和相互作用相关的信息，图中橙红色区域表示相邻TM螺旋以及空间上紧邻的TM螺旋之间具有一定的相互作用。TM2、TM3、TM6和TM7螺旋内以及各自和其余螺旋之间存在强烈的正相关，归因于配体结合在这四个螺旋的胞外侧，进而触发了螺旋之间的相互作用和构象变化。具体的说，TM6和TM2、TM3、以及TM7呈正相关，对应受体的“传输开关”W293^6.48和钠离子结合位点(D114^2.50、N150^3.35、S154^3.39、N328^7.45和S329^7.46)的相互作用，实验表明保守残基W293^6.48的侧链朝向变化会导致钠离子结合口袋的重排 [24] 。TM2、TM3和TM7上部分残基通过水分子形成极性网络，稳定了MOR的非活性构象 [25] 。其次TM5和TM3、TM6之间有较强的正相关，是由于W293^6.48和关键的PIF基序[Pro244^5.50-Ile155^3.40-Phe289^6.44]共同构成所谓的CR，转导了LBD和ICD之间的变构通讯 [26] 。

接收和传递变构信号的重要残基通常是蛋白质相互作用网络的中心，位于大多数残基之间的最短路径上。通过依次移除氨基酸网络中的节点及其相连通路，计算特征路径长度变化的Z-score分数，来量化

残基对网络内通信的影响，结果如 图6(a) 所示，共识别出22个关键残基簇。对氨基酸网络影响比较大的残基主要分布在TM2、TM3、TM6和TM7上，表明这些区域在变构通信中起重要作用，与运动相关性分析的结果( 图5 )一致。将Z-score分数映射到MOR结构上，并标注值高的簇对应的中心残基(Z-score ≥ 1.5， 图6(b) )。按照信号从胞外侧向胞质侧传递的顺序逐个分析：W318^7.35参与形成疏水口袋，很大程度上有助于与配体的相互作用。Y166^3.51通过与其它残基形成广泛的氢键网络来稳定TM3和TM6之间的连接，从而稳定MOR的非活性结构 [25] 。A337^7.54与K344^8.51的螺旋内接触则有利于维持TM7的外移 [27] 。R277^6.32与R280^6.35在G蛋白偶联区域，该区域与配体结合口袋存在弱偶联，被认为是潜在的变构调节剂结合口袋 [28] 。对于残基M90^1.54，尚未有相关研究发现它在变构通信中的作用，其潜在的功能还需实验证实。