金花葵的鲜花(盛花期，花瓣完全展开)和嫩叶片，采集于邢台木阳农业科技科技开发有限公司基地(河北省邢台市内丘县)内，高海拔样品金花葵采集自内丘县黄岔村金花葵繁育基地(海拔619 m，山地SD)，低海拔样品金花葵采集自内丘县小马河流域金花葵种植基地(海拔94 m，平原PY)。分别于山地、平原各5个不同地块进行样本采集。不同地块的金花葵均为相同时间播种，进行统一水肥管理。对采集的金花葵叶片(避光保存)及花朵去除花柄、叶柄，用去离子水冲洗后60℃烘干至恒重，粉碎后过60目筛，放于阴凉干燥处备用。

高速万能粉碎机(天津泰斯特)；台式高速离心机(TG16-WS，湘南赛特湘仪)；大容量离心机(TDL-5-A，上海安亭)；紫外可见分光光度计(UV 5200，上海元析)；数显恒温水浴锅(HH-2，国华电器)；雪花制冰机(DTY-ZBJ-40，北京德天佑科技)；电子天平(CP114，奥豪斯)；电热鼓风干燥箱(101AB-1型，山东省菏泽市南城益发)；微波消解仪(GT-400，屺尧科技)；原子吸收分光光度计(SP-3520AAPC，上海光谱)；原子荧光光度计(AFS-8220，北京吉天)。

丙酮、无水乙醇(天津益力)、碳酸钙(天津红岩试剂厂)、蒽酮Anthrone(上海蓝季生物)、硝酸(天津市大茂)，浓硫酸(天津市大茂)、葡萄糖(天津红岩)、95% 乙醇(天津益力)、碳酸氢钠(天津红岩)、苯酚、考马斯亮蓝、氯化锶、2,6-二氯靛酚钠盐(凯玛生化天津)、Coqmassie Bnlliant Blue G-50 Amersco、牛血清白蛋白(金克隆北京生物)、草酸(天津红岩)、85%磷酸、抗坏血酸、石英砂、超纯水(18.2 Ω)、镁标准溶液、铁标准溶液、锰标准溶液、锌标准溶液、钙标准溶液、铜标准溶液、硒标准溶液。

分别称取干燥叶片粉各1 g，放到研钵中，加少量石英砂和碳酸钙，加入少量丙酮、无水乙醇混合液，研成匀浆，再加混合液5 mL，继续研磨至糊状，静置3~5 min。取滤纸置于漏斗中，用混合液湿润，沿玻璃棒把提取液倒入漏斗，滤液流进25 mL容量瓶中；用少量混合液冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。用滴管吸取混合液，将滤纸上的叶绿体色素全部洗进容量瓶，直至滤纸和残渣中绿色消失为止。最后用混合液定容至25 mL，摇匀，并做好标记。

吸取上述待测容液各1 mL，稀释10倍后，进行吸光值的测定。以丙酮、无水乙醇混合液作为空白对照，分光光度计设置波长663 nm和645 nm，测定吸光值。并按下列公式进行计算。

$C_a\left(\text{mg}/\text{L}\right)=12.7O{D}_{663\text{nm}}-2.69O{D}_{645\text{nm}}$(1)

$C_b\left(\text{mg}/\text{L}\right)=12.7O{D}_{645\text{nm}}-2.69O{D}_{663\text{nm}}$(2)

$C_T\left(\text{mg}/\text{L}\right)=C_a+C_b$(3)

$叶绿素含量\left(\text{mg}/\text{g}\right)=\frac{C_T\times 25}{1000\times W}$(4)

C_a(mg/L)：叶绿素a浓度；

C_b(mg/L)：叶绿素b浓度；

C_T(mg/L)：总的叶绿素浓度。

采用蒽酮比色法测定可溶性糖含量。

分别称取0.1 g干燥的金花葵花粉末，加入蒸馏水研磨成匀浆；置于80℃水浴中浸提30 min；4000 r/min离心10 min，取上清液定容至50 mL备用，做好标记。

吸取待测液各1 mL，稀释10倍。取稀释后溶液各1 mL放入试管中，依次测定样品。

计算公式： $可溶性总糖含量\left(\text{\%}\right)=\frac{C\times V}{W\times {10}^6}\times 100\%$(5)

C (µg/mL)：吸光值代入标准曲线得到滤液中的糖含量；

V (mL)：滤液体积；

W (g)：样品称重量。

取6支干燥洁净的试管按照 表1 顺序加入试剂，进行测定。加入蒸馏水后立即混匀，管口加塞放入沸水中，以防蒸发。

以标准葡萄糖含量(mg/mL)为横坐标，吸光值为纵坐标，做出标准曲线，如 图1 。

采用Brandford法对蛋白质含量进行测定。

准确称取干燥的金花葵花粉末各0.1 g，加入6 mL蒸馏水研磨成匀浆；将匀浆转移到离心管中，以4000 r/min离心10 min；取上清液，用蒸馏水定容至10 mL，作为样品待测液。

$样品中蛋白质的含量\left(\text{mg}/\text{g}\right)=\frac{C\times \frac{V}{V_1}}{W\times 1000}$(6)

C (mg/mL)：吸光值代入标准曲线得到滤液中的蛋白质含量；

V (mL)：提取液总体积；

V₁(mL)：测定时加样量；

W (g)：样品测定量。

取16支试管，按照 表2 顺序加入试剂。以蛋白质含量(mg/mL)为横坐标，以吸光值为纵坐标绘制标准曲线，如 图2 。

采用2,6-二氯靛酚法测定VC含量。

各称取干燥的金花葵花粉末1 g，放入研钵中，加入少量20 g/L草酸溶液，在冰浴条件下研磨成浆状。转入100 mL容量瓶中，用20 g/L草酸溶液冲洗研钵后倒入容量瓶，再用20 g/L草酸溶液定容至刻度，摇匀。提取10 min后，4000 r/min离心10 min，收集上清液备用。

用移液管吸取10 mL上清液置于100 mL的三角瓶中，用已经标定的2,6-二氯酚靛酚溶液滴定至出现微红色，15 s不褪色，记下染料用量。重复三次。以10 mL 20 g/L草酸溶液作为空白，用移液管吸取10 mL 20 g/L草酸溶液置于100 mL的三角瓶中，用已经标定的2,6-二氯酚靛酚溶液滴定至出现微红色，15 s不褪色，记下染料用量。重复三次。

$每1\text{mL}染料溶液相当于抗坏血酸的毫克数=滴定度\left(T\right)=C\times \frac{标准抗坏血酸体积}{滴定体积}$(7)

$抗坏血酸含量\left(\text{mg}/100\text{g}\right)=\frac{V\times \left(V_1-V_0\right)\times \rho }{V_s\times m}$(8)

V (mL)：提取液总体积；

V₁(mL)：染料消耗测定量；

V₀(mL)：染料消耗空白量；

V_s(mL)：吸取滤液体积；

m (g)：样品质量；

ρ (mg/mL)：染料标定值。

采用苯酚–硫酸法测定多糖含量。

参考巫玲丽等 [24] 优化后的金花葵多糖提取工艺，准确称取1.000 g山地金花葵花粉末5组和平原金花葵花粉末5组，分别放于250 mL锥形瓶中，采取优化后的提取工艺，设置料液比1:50，超声温度为50℃和超声时间为30 min进行金花葵花多糖提取。

取多糖沉淀使用蒸馏水溶解，稀释后倒入200 mL容量瓶中，用蒸馏水定容到刻度线，充分摇匀后得到样品溶液。将样品溶液溶解隔夜后离心10 min，离心速度4000 rpm。将上清液取出2 mL放置于10 mL具塞试管中，加入1.0 mL现配的5%的苯酚溶液，充分混匀后，延试管壁加入5.0 mL浓硫酸，缓慢摇匀使用橡胶塞封口后迅速放入沸水中水浴加热15 min，时间到立即放置在冰水混合液中冷却10 min，待温度冷却至室温后，在490 nm处测定多糖溶液的吸光度，将数据代入葡萄糖标准曲线，综合稀释倍数，计算出质量。

多糖得率(%) = (多糖质量 × 稀释倍数 × 定容体积) ÷ 干燥金花葵粉末 × 100%(9)

计算公式： $多糖含量\left(\%\right)=\frac{C\times V}{W\times {10}^6}\times 100\%$(10)

C (µg/mL)：吸光值代入标准曲线得到滤液中的糖含量；

V (mL)：滤液体积；

W (g)：样品称重量。

测定金花葵花多糖含量采用苯酚–硫酸法。准备7支干燥且洁净的具塞试管根据 表4 依次加入试剂，进行吸光值检测。具体如下：每管中依次加入不同体积的葡萄糖标准液和蒸馏水(共计2.0 mL)立即混匀，再向7支试管中各加入1.0 mL 5%苯酚试剂，充分摇匀，之后在各试管沿试管壁缓慢加入5 ml浓硫酸，轻缓地充分摇匀后用橡胶塞封住管口放入沸水浴里加热15 min，防止蒸发；取出迅速置于冰水混合液中冷却10 min，待冷却至室温。以管0为空白对照，在490 nm处测其余管的吸光值。

以标准葡萄糖含量(mg/mL)为横坐标，吸光值(A)为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线，如 图3 。对不同质量的葡萄糖使用苯酚–硫酸法在490 nm处测定吸光值，其建立回归方程是：y = 5.5658x + 0.0406 (R²= 0.994)，在质量0.01 mg~0.1 mg范围内，葡萄糖质量与吸光值在此倍数内线性呈直线。

Se含量的测定采用原子荧光法测定，其他各元素含量测定均采用火焰原子吸收法。

取花瓣样品粉末0.4 g(重复3次)，用纸将样品置于微波消解仪消解罐底部，防止样品粘附与消解罐内罐，之后加入8 mL浓硝酸，使浓硝酸与样品混合均匀，按照消解仪操作步骤消解，待消解完成，降温至60℃以下，之后于通风橱内控制温度为150℃左右的电热板上蒸干多余的酸，赶酸至样品约1 mL，取出样品置于容量瓶中，多次用超纯水洗涤内罐，洗涤液至容量瓶，定容50 mL，放入冰箱备用。

将Mg、Zn、Fe、Cu、Mn、Ca、Se储备溶液(1 mg/mL)，分别配置成一定的浓度梯度，溶液用1%的硝酸来定容，定容体积为50 mL，各种元素标准溶液浓度梯度，如 表5 所示。

Mg、Ca标准曲线的浓度配置与其他素大致相同，但为避免其他元素的干扰，需加入2 mL 30% SrCl₂。打开总电源开关，打开通风橱，排风报警，之后打开计算机操作系统，选择工作灯和预热灯，预热15分钟，设置好条件后自动寻峰。接下来即建立校正方程，先设置好标准样品数量点，设置相对应的样品梯度点，样品属性，打开空气压缩机，当压力表达到0.25 mpa且稳定不变时打开乙炔，减压阀调到0.06 mpa，最后点火调零，将毛细管放入待测液，从低浓度到高浓度依此测量，完成测量，保存数据。测定各标准溶液并绘制各元素标准曲线图。

将消解好的样品稀释到一定的浓度定容体积为25 mL，Ca、Mg要加入1 mLSrCl₂以和标液于相同的条件，测量吸光度，保存数据，利用标准曲线方程求出金花葵花瓣各元素的含量。各待测样品溶液的稀释倍数为Mg稀释5倍，Zn稀释10倍，其他未作稀释处理。实验重复三次，取平均值。

海拔较高地区的金花葵花有机物含量与海拔较低地区的金花葵花有机物含量存在极显著性差异，即不同海拔生长环境对金花葵叶绿素含量、可溶性多糖含量、有可溶性蛋白质含量、VC含量以及多糖均呈现显著性影响。山地生长金花葵叶片中叶绿素含量、金花葵花朵中可溶性蛋白质含量和多糖含量均高于平原生长的金花葵，而山地生长金花葵花朵中可溶性糖含量和VC含量低于平原生长的金花葵花朵。

注：p值 < 0.05。

注：p值 < 0.05。

由 表7 可以看出，邢台内丘海拔较高地区生长的金花葵花瓣各元素含量分别为Mg：82.82 μg/g、Zn：72.24 μg/g、Fe：100.58 μg/g、Cu：6.34 μg/g、Mn：4.50 μg/g、Ca：338.50 μg/g、Se：0.066 μg/g，海拔较低地区生长的金花葵花瓣各元素含量分别为Mg：78.51 μg/g、Zn：66.43 μg/g、Fe：114.14 μg/g、Cu：5.48 μg/g、Mn：2.43 μg/g、Ca：356.21 μg/g、Se：0.056μg/g，海拔较高地区生长的金花葵花瓣中相对来说Mg、Zn、Mn、Cu、Se含量均高于海拔较低地区生长的金花葵，Fe、Ca含量较多稍低。

海拔高度对金花葵生长具有促进作用，山地生长的金花葵叶片中的叶绿素含量远高于平原生长的金花葵。叶绿素是茎叶体植物进行光合作用最重要的色素，含量多增强植物光合作用，含量少光合作用减弱 [25] - [27] 。随着海拔的变化，昼夜温度、日照强度、紫外线强烈程度等都会发生变化，对植物生长发育造成影响 [28] [29] 。光照是影响植物中叶绿素含量的主要因子，山地海拔高，光照充足，叶绿素含量高；山地海拔高，云雾多，植物受到大量以蓝紫光为主的短波光的长期照射，提高了叶绿素的含量。如刘文瑜等 [30] 针对藜麦苗期生理指标与海拔关系的研究，可证明海拔升高，温度降低，光照增加，使叶绿素得到积累。史作民等 [31] 研究了高山植物叶片受海拔高度响应及其机理，发现海拔高度影响植物叶片δ13C的含量、气孔导度、羧化效率和叶片含氮量。

山地生长的金花葵花朵中的可溶性糖含量低于平原生长的金花葵，而多糖和可溶性蛋白质含量均高于平原生长的金花葵。段鹏伟研究了“富士”苹果果实品质与海拔的相关性，认为海拔高度在700 m以下时，较高的海拔能够显著提高果实的外观品质和可溶性固形物含量，海拔高度与果实质构特性显著相关 [32] 。高海拔地区和低海拔地区的金花葵花的多糖含量不同的原因之一可能与多糖的代谢有关，其次不同的地理位置和环境导致金花葵的日照时间、昼夜温差、土壤酸碱度等不同的因素。蒋欣梅 [8] 对不同海拔老山芹多糖含量进行分析，结果表明海拔高度与多糖含量和可溶性糖含量呈显著相关，因此不同海拔对多糖和可溶性糖含量具有差异。在低海拔、湿温度较大的环境条件下，植物内相当多的一部分淀粉转化为可溶性糖，可溶性糖含量增加。栗孟飞 [33] 对桃儿七果实的研究和刘淑云 [34] 对玉米的研究证实了平原生长植物中所含可溶性糖含量高于山地生长植物的可能性，增加了实验的可信度。可溶性糖主要调节植物细胞渗透液，使蛋白质的合成减少。低海拔高湿度淀粉转化为可溶性糖，造成海拔高，可溶性糖减少，可溶性蛋白增多的现象 [35] - [37] ；海拔高，昼夜温差大，有利于蛋白质的储存和积累，使山地生长的金花葵含有更高的可溶性蛋白。

山地生长的金花葵花朵中的VC含量低于平原生长的金花葵。VC的含量受海拔高度和年平均气温影响 [38] ，不同植物在不同海拔高度受不同因素影响会造成不同的结果 [39] [40] 。陈钰祺等 [41] 研究了毕节市三种高海拔(海拔2000 m、海拔1600 m、海拔1480 m)对果实产量和品质的影响，认为海拔对果实产量和品质的影响是相关气候因子间接作用的综合结果，不同海拔对刺梨果实维生素C含量影响较大，海拔1480 m生长的刺梨果实的维生素Ｃ含量最高。金花葵VC含量随海拔变化规律，有待进一步研究探索；其他条件因素对金花葵VC含量的影响，目前也处于一片空白，有一定的科研意义。

金花葵富含矿质元素，本研究检测了河北内丘不同海拔高度种植的金花葵的7种主要矿质元素，发现其花朵中Fe、Cu、Mn、Zn和Mg含量均远高于前人报道的江西宜春市袁州区西村镇西双村(海拔95 m，江西)种植的金花葵 [42] ，尤其是Fe、Zn和Ca含量较高，与同属的黄秋葵和红秋葵相比，金花葵中的Fe、Ca和Zn含量也远高于芮鸿飞报道的可食用的黄秋葵和红秋葵嫩果荚 [43] ，而与李浡 [44] 测得平顶山(海拔657 m，河南)金花葵花瓣中矿物质含量相差较少，但Zn含量较高。在与前人研究的平顶山、宜春金花葵的花瓣矿物质元素比较中，邢台内丘的金花葵花瓣Zn含量最多，Mg、Fe、Cu的含量居中，Ca含量多于漯河 [45] 金花葵花瓣含量。