供试材料为拟南芥野生型(Col-0)、类NO合酶(NOS)基因突变体Atnoa1、硝酸还原酶(NR)基因突变体nia1-2、nia2-1和nia1-2/nia2-5、L-/D-半胱氨酸脱巯基酶缺失突变体Atd-cdes和Atl-cdes为材料。Atnoa1、nia1-2、nia2-1和nia1-2/nia2-5突变体由贺军民教授(陕西师范大学)惠赠，拟南芥野生型(Col-0)、Atd-cdes和Atl-cdes突变体均购自诺丁汉拟南芥储存中心(Nottingham Arabidopsis Stock Centre, NASC, UK)。材料培养参照黄丽萍(2023)所述方法。选取生长4-5周完全展开的野生型及各突变体莲座叶作为实验材料。以下处理条件均为：光照强度为(100 μmol·m⁻²·s⁻¹)，温度为22℃ ± 2℃，处理时间为3 h。

NO特异性荧光探针(4,5-diaminofluorescein diacetate, DAF-2DA)、NO清除剂2-4,4,5,5-苯-四甲基咪唑-1-氧-3-氧化物[2-(4-carboxyenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxidepotassium salt, cPTIO]、NOS抑制剂N_ω-硝基-L-精氨酸-甲酯(N_ω-nitro-L-arginine methyl ester, L-NAME)、NR抑制剂钨酸钠(sodium tungstate dehydrate, Na₂WO₄)、H₂S氨氧基乙酸(aminooxyacetic acid, AOA)和羟胺(hydroxylamine, NH₂OH)、二硫苏糖醇(dithiothreitol, DTT)、L-半胱氨酸(L-cysteine, L-Cys)、D-半胱氨酸(D-cysteine, D-Cys)、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)和2-(N-吗啡啉)乙烷磺酸[2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid, MES]均购自Sigma-Aldrich公司(St Louis, MO, USA)；其他试剂均为国产分析纯。

气孔开度测定参考McAinsh等人 [22] 描述的方法并稍作修改。撕取叶片下表皮，用刷子刷掉叶肉细胞，置于MES/KCl缓冲液(10 mmol·L⁻¹MES，50 mmol·L⁻¹KCl, 100 µmol·L⁻¹CaCl₂, pH 6.15)中光照3 h使气孔开放，然后表皮条用于以下实验。为了研究CdCl₂对野生型气孔开度的影响，表皮条分别用含有0、100、200、300和400 µmol·L⁻¹CdCl₂的MES/KCl缓冲液处理1 h、2 h和3 h，然后用装有目镜测微尺的光学显微镜测定气孔开度；为了研究CdCl₂对气孔的效应是否可以恢复，先将表皮条分别用含有0、100、200、300和400 µmol·L⁻¹CdCl₂的MES/KCl缓冲液处理3 h，然后将表皮条放到MES/KCl缓冲液中再恢复处理3 h，然后测定气孔开度；为了研究H₂S合成抑制剂及NO清除剂和合成抑制剂对CdCl₂诱导野生型气孔关闭的影响，表皮条分别用MES/KCl缓冲液单独或含有300 µmol∙L⁻¹CdCl₂、0.4 mmol·L⁻¹AOA、0.4 mmol·L⁻¹NH₂OH、0.4 mmol·L⁻¹C₃H₃KO₃+ 0.4 mmol·L⁻¹NH₃、200 µmol·L⁻¹c-PTIO、25 µmol·L⁻¹L-NAME、100 µmol·L⁻¹Na₂WO₄及300 µmol∙L⁻¹CdCl₂分别与H₂S合成抑制剂及NO清除剂和合成抑制剂混合液的MES/KCl缓冲液处理3 h，然后测定气孔开度；为了研究CdCl₂对野生型和突变体Atl-cdes、Atd-cdes、Atnoa1、nia1-2、nia2-5和nia1-2/nia2-5气孔的效应，野生型和以上各突变体的表皮条分别用不含或含有300 µmol∙L⁻¹CdCl₂的MES/KCl缓冲液处理3 h，然后测定气孔开度。每个处理至少重复三次，最终数据为三次测量所得数据的平均值 ± 标准误差(n = 90)。

H₂S含量的测定采用亚甲基蓝法 [23] [24] ，具体步骤参考黄丽萍 [25] 的方法。在研究H₂S合成抑制剂及NO清除剂和合成抑制剂对CdCl₂诱导的野生型叶片H₂S含量的影响及CdCl₂对野生型和突变体Atl-cdes、Atd-cdes、Atnoa1、nia1-2、nia2-1和nia1-2/nia2-5叶片H₂S含量的影响时，叶片处理方法与气孔开度测定部分的处理相同，处理结束后，测定H₂S含量。每个处理至少重复三次，最终数据为三次测量所得数据的平均值 ± 标准误差(n = 9)。

L-/D-CDes活性的测定参照侯智慧等 [24] 和Riemenschneider等 [26] 的方法并稍作修改，具体步骤参考黄丽萍 [25] 的方法。叶片中L-/D-CDes活性测定前，叶片的处理方法与H₂S含量测定部分的相同。每个处理至少重复三次，最终数据为三次测量所得数据的平均值 ± 标准误差(n = 9)。

保卫细胞NO水平检测借助于特异性荧光探针DAF-2DA，参照Kojima等 [27] 的方法并稍加修改，具体步骤参考黄丽萍 [25] 的方法。为了检测NO清除剂和合成抑制剂对CdCl₂诱导野生型保卫细胞NO水平的影响，表皮条分别用MES/KCl缓冲液单独或含有300 µmol∙L⁻¹CdCl₂、0.4 mmol·L⁻¹AOA、0.4 mmol·L⁻¹NH₂OH、0.4 mmol·L⁻¹C₃H₃KO₃+ 0.4 mmol·L⁻¹NH₃、200 µmol·L⁻¹c-PTIO、25 µmol·L⁻¹L-NAME、100 µmol·L⁻¹Na₂WO₄及300 µmol∙L⁻¹CdCl₂分别与H₂S合成抑制剂及NO清除剂和合成抑制剂混合液的MES/KCl缓冲液处理3 h，处理结束后立即用含有50 μmol·L⁻¹H₂DCF-DA的Tris-KCl缓冲液(10 mmol·L⁻¹Tris, 50 mmol·L⁻¹KCl, pH 7.2) 25℃ ± 2℃避光孵育10 min，多余的探针用Tris-KCl缓冲液漂洗3-5次，然后用荧光显微镜(Olympus BX53, U-RFLT50, JAPAN)检测NO并拍照；为了检测CdCl₂对野生型和突变体Atl-cdes、Atd-cdes、Atnoa1、nia1-2、nia2-5和nia1-2/nia2-5保卫细胞NO水平的效应，野生型和以上各突变体的表皮条分别用不含或含有300 µmol∙L⁻¹CdCl₂的MES/KCl缓冲液处理3 h，处理结束后立即用含有10 μmol·L^–1DAF-2DA的Tris-KCl缓冲液25℃ ± 2℃避光孵育30 min，多余的探针用Tris-KCl缓冲液漂洗3-5次，然后用荧光显微镜检测NO并拍照。检测条件为：激发波长为450~490 nm，发射波长为520~560 nm。利用Photoshop 7.0 (Adobe, San Jose, CA, USA)对显微照片的整个气孔区进行处理和分析。每个处理至少重复3次。

试验中每个处理3次重复，在SPSS 17.0进行数据整理与分析，进行描述统计分析得出不同处理组的平均值、标准差等基本情况，在满足方差齐性和正态分布的前提下，进行描述统计分析和比较均值下的单因素ANOVA检验得到平均值、标准误差以及数据之间存在的显著性，当P值小于0.05时，认为数据间存在显著性差异并用不同字母表示，数值以平均值 ± 标准误差表示，用Origin 6.1软件(Microcal Software, Nothampton, MA, USA)绘制柱形图；用Photoshop 7.0制作图版。

为了探明CdCl₂是否影响拟南芥气孔运动，检测了不同浓度CdCl₂(0、100、200、300和400 µmol·L⁻¹)对野生型拟南芥气孔开度的效应。 图1(A) 结果显示，CdCl₂能诱导野生型气孔关闭，随着Cd²⁺浓度的增加，气孔开度逐渐减小，CdCl₂对气孔关闭具有剂量和时间依赖效应。300 µmol·L⁻¹CdCl₂处理3 h诱导气孔关闭的效果最佳。 图1(B) 结果表明，CdCl₂诱导气孔关闭的效应具有可逆性。

为探明H₂S是否是CdCl₂诱导拟南芥气孔关闭过程中的重要信号成分，检测了H₂S合成抑制剂AOA、NH₂OH与C₃H₃KO₃+ NH₃(L-/D-CDes催化反应产物)对CdCl₂诱导野生型气孔关闭的效应及CdCl₂对突变体Atl-cdes和Atd-cdes气孔的影响。由 图2(A) 可知，CdCl₂处理显著诱导拟南芥气孔关闭，AOA、NH₂OH和C₃H₃KO₃+ NH₃均可不同程度地抑制CdCl₂诱导的气孔关闭，而AOA、NH₂OH和C₃H₃KO₃+ NH₃单独处理对气孔开度并无明显影响。 图2(B) 显示，与野生型相比，CdCl₂未能显著关闭Atl-cdes和Atd-cdes突变体的气孔。由以上数据可以得出，H₂S可能是CdCl₂诱导拟南芥气孔关闭过程中的重要信号组分，H₂S的合成可能依赖于L-CDes和D-CDes途径。

为进一步证明CdCl₂诱导气孔关闭过程中H₂S产生的具体酶学途径，测定了AOA、NH₂OH以及C₃H₃KO₃+ NH₃对CdCl₂诱导野生型叶片H₂S含量和L-/D-CDes活性变化的影响。结果显示，CdCl₂处理后叶片H₂S含量和L-/D-CDes活性升高，而AOA、NH₂OH以及C₃H₃KO₃+ NH₃可以显著逆转CdCl₂的效应( 图3(A)~(C) )。以上数据表明，L-/D-CDes催化合成的H₂S参与CdCl₂诱导的拟南芥气孔关闭过程。

为了探明NO是否参与CdCl₂诱导的拟南芥气孔关闭过程，检测了NO清除剂c-PTIO、硝酸还原酶(NR)抑制剂钨酸钠(Na₂WO₄)和一氧化氮合酶(NOS)抑制剂L-NAME对CdCl₂诱导野生型气孔关闭效应。 图4(A) 显示CdCl₂显著诱导野生型气孔关闭，c-PTIO、Na₂WO₄和L-NAME均能明显抑制以上效应，而c-PTIO、Na₂WO₄和L-NAME单独处理对气孔开度无显著效应。另外，CdCl₂处理不能诱导Atnoa1、nia1-2、nia2-1和nia1-2/2-5突变体气孔关闭( 图4(B) )。由此推测，NO可能参与CdCl₂诱导的拟南芥气孔关闭，且此过程中NO的产生由NR和NOS负责合成。

为进一步证明NO参与CdCl₂诱导的气孔关闭过程，检测了c-PTIO、Na₂WO₄和L-NAME与CdCl₂复合处理对野生型保卫细胞NO水平的影响。结果表明，CdCl₂能显著促进野生型保卫细胞NO合成( 图5(A) 、 图5(B) )，而c-PTIO、Na₂WO₄和L-NAME能阻断CdCl₂诱导保卫细胞NO合成的效应( 图5(C)~(E) )。此外，CdCl₂未能诱导Atnoa1、nia1-2、nia2-1和nia1-2/nia2-5突变体保卫细胞NO合成。由此可以证实，在CdCl₂诱导拟南芥气孔关闭过程中，NO是由NR和NOS催化产生，Atnoa1、Nia1和Nia2均参与NO的生成。

以上结果已经证明，H₂S和NO都参与CdCl₂诱导的拟南芥气孔关闭过程，为进一步探明H₂S和NO的关系，检测了c-PTIO、Na₂WO₄和L-NAME对CdCl₂诱导野生型叶片H₂S合成和L-/D-CDes活性升高的影响。结果显示，与对照组相比，CdCl₂显著诱导叶片H₂S含量和L-/D-CDes活性升高，而c-PTIO、Na₂WO₄和L-NAME阻断了以上效应( 图6(A)-(C) )。以上结果暗示，在CdCl₂调控拟南芥气孔关闭过程中，NR途径和NOS途径合成的NO共同介导H₂S的合成，进而诱导拟南芥气孔关闭。

为了进一步证实H₂S和NO的关系，检测了CdCl₂对Atnoa1、nia1-2、nia2-1和nia1-2/nia2-5突变体叶片H₂S含量和L-/D-CDes活性的影响。结果显示，CdCl₂显著增加野生型叶片H₂S含量和L-/D-CDes活性，但此效应在Atnoa1、nia1-2、nia2-1和nia1-2/nia2-5突变体中被阻断( 图7(A)~(C) )。由此推断，NR途径和NOS途径合成的NO均介导CdCl₂诱导的H₂S合成。

图7. CdCl₂对Atnoa1、nia1-2、nia2-1和nia1-2/nia2-5突变体叶片H₂S含量(A)和L-/D-CDes活性的影响((B), (C))

为了进一步证实NO位于H₂S的上游介导CdCl₂诱导的气孔关闭，用H₂S合成抑制剂分别与CdCl₂复合处理，检测野生型保卫细胞NO水平，并检测了CdCl₂对Atl-cdes和Atd-cdes突变体保卫细胞NO产生的影响。结果显示，CdCl₂处理后野生型保卫细胞DAF-2荧光比对照组显著增强( 图8(A) 、 图8(B) )，而H₂S合成抑制剂AOA、NH₂OH和C₃H₃KO₃+ NH₃不能抑制CdCl₂诱导的DAF-2荧光增强( 图8(C)-(E) )。另外，CdCl₂对Atl-cdes和Atd-cdes突变体保卫细胞DAF-2荧光的增强效果与野生型相同( 图8(F) ， 图8(G) )。以上结果进一步证实了NO确实位于H₂S上游介导了CdCl₂诱导拟南芥气孔关闭过程的结论。