宫颈癌细胞系HeLa (由青岛市市立医院细胞移植重点实验室提供)，胎牛血清(FBS)和细胞培养基(DMEM)购自大连美仑生物有限公司，BCA试剂盒购自上海爱必信生物科技有限公司，TFRC抗体、Beclin-1抗体、P62/SQSTM1抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司，ERK抗体、p-ERK抗体、AKT抗体、p-AKT抗体，mTOR抗体、p-mTOR抗体、LC3B抗体、GAPDH抗体购自上海艾比玛特医药科技有限公司，细胞周期检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，小干扰siRNA购自广州市锐博生物科技有限公司，转染试剂Lipofectamine2000购自赛默飞世尔科技中国公司，慢病毒购自上海吉凯基因科技有限公司。

将宫颈癌细胞系HeLa放置在含有10% FBS和1%双抗(青霉素和链霉素)的DMEM中，37℃，5% CO₂，饱和湿度培养，待细胞密度达到对数生长期时按1:2传代及用于后续实验。由锐博生物科技有限公司设计siRNA三个敲低位点；通过上海吉凯基因科技有限公司将敲低效率最高位点构建成敲低TFRC的慢病毒，用于感染细胞。感染后，用嘌呤霉素筛选细胞，获得敲低TFRC的稳转株。将细胞分为空白对照组、TFRC敲低阴性对照组、TFRC敲低组。

将各组宫颈癌细胞(约5 × 10³个/孔)接种于96孔板，每组设6个复孔。细胞贴壁后培养基继续培养24、48、72 h，根据CCK-8试剂操作说明，每孔加入CCK8试剂10 ul，培养箱孵育1.5 h。在波长450 nm下，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度，每组去掉一个最大值、一个最小值，其余四孔取平均值，计算相对细胞活力。

先在6孔板背面间隔0.5~1 cm划线，接种各组宫颈癌细胞(约5 × 10⁵个)，置于培养箱中培养过夜细胞贴壁后。用10 μL枪头垂直划线，分别于0、24、48 h在显微镜下观察、拍照，Image J软件分析划痕面积。划痕愈合率 = (0 h划痕面积 − 当前划痕面积) × 100%/0 h划痕面积。

收集各组宫颈癌细胞约2 × 10⁵个，用预冷的PBS洗涤、离心后弃上清，将细胞加入1 ml预冷的70%乙醇中，吹打混匀，4℃固定2小时。固定好的细胞再次清洗、离心后弃去上清，加入配置好的碘化丙啶染色液中37℃避光温浴30分钟。用流式细胞仪在激发波长488 nm波长处检测红色荧光，同时检测光散射情况。采用modfit软件进行分析。

将各组宫颈癌细胞密度培养至为90%以上时，加入RIPA中效裂解液和蛋白酶抑制剂后充分裂解，于4℃离心机中12,000 g离心7 min，取上清，用BCA法检测蛋白浓度，于剩余上清内加入约1/4体积的5×上样缓冲液与其混合均匀，100℃变性5 min。根据测得的蛋白浓度，进行电泳。电泳结束后，转移至PVDF膜上。用含5%脱脂奶粉的TBST液中室温封闭2 h，TBST洗膜10 min × 3次，分别孵育TFRC (1:1500)、ERK (1:1000)、P-ERK (1:1000)、AKT (1:1000)、p-AKT (1:1000)、m-TOR (1:1000)、p-mTOR (1:1000)、Beclin-1 (1:1000)、P62 (1:1000)、LC3(1:1000)和GAPDH (1:4000)一抗，置于4℃冰箱中过夜。室温孵育兔/鼠二抗(1:8000) 1 h，清洗后用ECL化学发光法显影。用GAPDH作为内参，Image J软件分析蛋白条带的灰度值，Graphpad Prism 8.0软件计算各蛋白的相对表达量。

本研究采用Graphpad Prism 8.0软件分析数据，所有数据均采用均值 ± 标准差( $\bar{x}\pm s$)，多组间差异采用单因素方差分析，两组间差异比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

Western Blot结果显示，TFRC敲低组TFRC蛋白表达量(0.1153 ± 0.01471)，明显低于TFRC敲低阴性对照组(0.9364 ± 0.01508)，差异有统计学意义(t = 67.53, P < 0.01)。TFRC敲低组自噬相关蛋白Beclin-1蛋白表达量(0.5602 ± 0.02051)、LC3II/LC3I蛋白表达量(0.5482 ± 0.02462)较TFRC阴性对照组(0.9030 ± 0.09905)、(0.9286 ± 0.03370)表达降低，P62蛋白表达量(1.111 ± 0.02134))较TFRC阴性对照组(0.9204 ± 0.04766)表达升高，差异均有统计学意义(t = 5.885, P < 0.05; t = 6.305, P < 0.05; t = 15.79, P < 0.01) (见 图1 )。

图1. 各组细胞中TFRC及自噬相关蛋白表达

通过CCK8实验检测各组细胞的增殖能力，结果表明，TFRC敲低组细胞吸光值在24 h (0.2580 ± 0.01473)、48 h (0.4793 ± 0.02084)和72 h (0.7593 ± 0.05652)均小于阴性对照组(24 h: 0.3550 ± 0.03291; 48 h: 0.06957 ± 0.0076; 72 h: 1.057 ± 0.177)，差异均有统计学意义(t = 4.660, P < 0.05; t = 16.90, P < 0.01; t = 5.181, P < 0.01)，而空白对照组和阴性对照组比较差异无统计学意义(t = 0.059, P > 0.05; t = 2.026, P > 0.05; t = 0.563, P > 0.05)。通过时间曲线(0、24、48 h和72 h)发现，敲低TFRC对抑制宫颈癌细胞的增殖能力呈现时间依赖性(见 图2 )。

通过细胞划痕实验表明，TFRC敲低组细胞迁移率在处理24 h和48小时后分别为(20.39 ± 2.124)%、(42.59 ± 1.993)%，与阴性对照组相比(39.09 ± 1.257)%、(54.47 ± 2.33)%明显降低，差异均有统计学意义(t = 4.614, P < 0.01; t = 0.6.802, P > 0.05)。而空白对照组和TFRC敲低阴性对照组比较差异无统计学意义(t = 0.798, P > 0.05; t = 0.580, P > 0.05) (见 图3 )。

图3. TFRC促进宫颈癌细胞迁移

通过流式细胞术检测细胞周期表明，TFRC敲低组G0/G1期细胞比例为(36.44 ± 1.195)%，较阴性对照组(52.34 ± 0.9878)%显著降低，G2/M期细胞比例(33.54 ± 1.087)%，较阴性对照组(17.07 ± 0.5315)%显著升高，差异均有统计学意义(t = 17.75, P < 0.01; t = 23.57, P < 0.01) (见 图4 )。

图4. TFRC对宫颈癌细胞周期的影响

Western Blot结果显示，TFRC敲低组磷酸化ERK (p-ERK)、磷酸化AKT (p-AKT)、磷酸化m-TOR (p-mTOR)蛋白表达量分别为(0.4528 ± 0.01231)、(0.7491 ± 0.02534)、(0.7645 ± 0.03308)，与阴性对照组相比(1.048 ± 0.01587)、(1.054 ± 0.02285)、(1.094 ± 0.01587)表达水平明显降低，差异均有统计学意义(t = 36.95, P < 0.01; t = 15.45, P < 0.01; t = 15.54, P < 0.01)。总蛋白ERK、AKT、mTOR的表达量基本不变(见 图5 )。

图5. 各组细胞中ERK/AKT/mTOR蛋白表达