新西兰大白兔(购自青岛康大爱博生物科技有限公司)，雄性，2月龄，体重约2.5~3.0 kg。

PCL (Sigma)，甲酸(Solarbio)，乙酸(Solarbio)，磁力搅拌器(美国，Sioma-AldrCh公司)，磁力搅拌子(比克曼)，ET静电纺丝一体机(北京永康乐业科技发展有限公司)，超声波分散仪(新芝生物)，电子天平(德国，Sartorius)电子显微镜(Hitachi)免疫荧光相关抗体：Phalloidin-iFluor 488抗体(abcom)、兔抗兔Tenascin C一抗(biobyt)，羊抗兔Alexa Fluor-488二抗(HUABIO)、兔抗兔Runx2一抗(博奥森)、羊抗兔Alexa Fluor-594二抗(Solarbio)、DAPI (Solarbio)。Cell counting kit-8 (Solarbio)，FBS (Gibco)，cell medium DMEM (Solarbio)，PBS (Solarbio)。

依据文献提取肌腱干细胞：取静脉采血的新西兰大白兔的髌腱、跟腱；在含10%双抗的PBS中放入肌腱组织，消毒5分钟，PBS液润洗3次；在肌腱组织中加入1 ml 0.05%trypsin-EDTA消化液消化，在孵育箱中消化5分钟，期间可行吹打，促使更好分离；加入完全培养基终止蛋白酶消化反应；把分离后的肌腱割成小块，加入肌腱消化液，在培养箱消化2小时，每隔半小时取出培养瓶，在无菌台上放置30秒，为室温；消化好后，使用70 um过滤器，过滤获得初步提取的兔肌腱干细胞；将获取的细胞，转移到新培养瓶，加入培养基，培养；每3天换液，当细胞铺满培养瓶80%时，可按照1:3传代；传代：使用移液枪将旧培养基移除，加入PBS润洗1次，再向培养瓶中加入0.05%的胰酶1 ml消化半分钟，消化后再加入等量的完全培养基终止反应，调整离心机参数为1000 rpm离心5 min。之后离心管中可看到上层为清液，下层为沉淀的分层情况，仔细将上层清液移除，不要吸到下方沉淀，之后再向离心管中加入完全培养基重悬后传代，于培养箱孵育。我们实验通常取用第2~4代的干细胞来完成后续实验( 图1(A) )。

i-PRF制备：自兔耳缘静脉取血10 ml，随即放入离心机1000 rpm，3 min，即可得到分层溶液，上层淡黄色液体即为i-PRF [10] ，另备无菌试管加入100 U肝素，将制得的i-PRF加入防止其凝固。

同轴静电纺丝：使用体积比等于3:1的乙酸甲酸5 ml为溶剂，加入11%wt的PCL，在磁力搅拌器上搅拌90 min，至完全溶解，此作为壳层溶液；取i-PRF为芯层溶液进行同轴静电纺丝，参数如下：电压16 kv，壳层溶液流速1 ml/h，芯层溶液0.1 ml/h，接收距离为15 cm ( 图1(B) )。

普通静电纺丝：使用体积比等于3:1的乙酸甲酸5 ml为溶剂，将制得的i-PRF取0.5 ml加入其中，于磁力搅拌器搅拌60 min至其完全溶解，再加入11%wt的PCL，于磁力搅拌器上搅拌90 min，至全部溶解，在电压为16 kv，流速为1.1 ml/h，接收距离为15 cm的条件下纺丝1 h，并收集( 图1(C) )。

将纤维材料用生物胶粘到与其大小一致的圆形破片上，然后做好标记分别放于24孔板中的不同区域。于含有75%酒精的酒精锅中熏蒸6小时，之后再于紫外线照射环境中照射1小时进行灭菌。取出24孔板，依次使用PBS、普通低糖DMEM润洗纤维材料2次，再将500 ul配置好的完全培养基加入到24孔板中，之后放入培养箱，给肌腱干细胞一个湿润的环境。自培养箱中取出培养瓶，使用移液枪将旧培养基移除，加入PBS润洗1次，再向培养瓶中加入0.05%的胰酶1 ml消化半分钟，消化后再加入等量的完全培养基终止反应，调整离心机参数为1000 rpm离心5 min。仔细将上层清液移除，不要吸到下方沉淀，之后再向离心管中加入3 ml完全培养基，通过血细胞计数板计算出密度。从培养箱中取出24孔板，在24孔板中按照1 × 10⁴/孔的浓度种植细胞，之后再向各孔中加入完全培养基，使各孔培养基含量在700 μm。于第3、7天行CCK-8实验，配制含10%CCK-8试剂的培养基，取出细胞培养瓶，使用移液枪将旧的培养基吸除，使用PBS将培养瓶润洗1次，在避光条件下每孔中加入400 ml含10%CCK-8试剂的新鲜培养基，之后再培养箱中孵育2小时。时间到后，轻轻摇晃15 min，使其充分混匀，取新的96孔板，吸取对应的24孔板中100 ul液体，做好标记。于450 nm处，使用酶标仪检测相对应的OD值。收集数据并分析。另第7天行蛋白免疫荧光检测，24孔板细胞培养7天后，吸出培养基，PBS洗涤3次；4%戊二醛固定10 min，PBS洗涤3次，注意配合枪头吹打；0.1%Triton X-100室温通透5 min，PBS洗3次，注意配合枪头吹打；1%BSA封闭1 h，PBS洗涤3次，注意配合枪头吹打；相同材料组一个加入兔抗兔Tenascin C一抗，另一个加入兔抗兔Runx2一抗，避光孵育，4℃过夜；0.1%Tween20洗一次，PBS洗涤2次，每次5 min，注意配合枪头吹打；加入兔抗兔Tenascin C一抗的加羊抗兔Alexa Fluor-488二抗；加入兔抗兔Runx2一抗的加羊抗兔Alexa Fluor-594二抗，避光室温孵育1 h；吸掉二抗；PBS洗涤3次，每次5 min注意配合枪头吹打；DAPI避光浸染10 min，PBS冲洗3次；荧光显微镜下观察。RunX2在荧光中显示为红色，Tenascin C显示为绿色，拍摄荧光图片使用ImageJ软件分析平均荧光强度。

实验①组：普通静电纺丝：n = 9 (第3、7天行CCK-8实验，第7天行蛋白免疫荧光检测)；

实验②组：同轴静电纺丝：n = 9 (第3、7天行CCK-8实验，第7天行蛋白免疫荧光检测)；

对照组：即空白对照，只含有普通圆形玻片(n = 6，第3、7天行CCK-8实验)。

因已知PRF对肌腱干细胞有促分化作用，因此不对空白对照和单纯PCL做荧光分析 [8] [9] 。

使用SPSS统计软件进行数据分析，每组间使用配对样本t检验，^*(p < 0.05)，^**(p < 0.01)，组间有统计学差异。

在CCK-8实验中，第3天时，对照组略高于两实验组，而普通静电纺丝组略高于同轴静电纺丝组组间无统计学差异；第7天时，对照组显著高于两实验组，两实验组组间无明显差异。出现这种情况的原因结合免疫荧光来看，应该是两实验组因添加i-PRF导致肌腱干细胞出现分化，故而细胞增殖减低( 图2(A) 、 图2(B) )。

从第7天做的蛋白免疫荧光及ImageJ软件处理结果来看，同轴静电纺丝组( 图3(B) 、 图3(D) )相比于普通静电纺丝组( 图3(A) 、 图3(C) )中肌腱干细胞的RunX2、Tenascin C表达更多，平均荧光强度更高( 表1 )，组间差异具有统计学意义( 图4 )，由此可见，添加i-PRF的同轴静电纺丝相比于普通静电纺丝，对于肌腱干细胞的分化促进作用更大，更有益于肌腱–骨界面组织损伤修复。