于湖北省利川市(东经：108˚21'；北纬：29˚42')采集野生鱼腥草叶片，由湖北大学生命科学学院黄岚杰老师鉴定并确认，方法为五点取样法，采集叶片于−80℃保存。雷尔氏青枯菌(Ralstonia solanacearum)采购自于上海迈瑞尔化学技术有限公司。

实验仪器包括：Spectra Max iD3酶标仪；Easysep-3030高效液相色谱仪；德国LABCONCO低温浓缩仪。

NA/NB培养基原材料、甲基正壬酮标品、红四氮唑、结晶紫染液于上海阿拉丁生化科技股份有限公司采购。

将鱼腥草叶片洗净后晾干，将剪碎的叶片放入研钵中，加入无水甲醇/去离子水直至覆盖住叶片，使用研杵碾碎叶片，将鱼腥草叶片完全碾碎后使用移液枪吸取液体转移至1.5 mL离心管中，1500 rpm离心5 min，吸取上清得到甲醇/水提取液。

本次实验选用NA/NB培养基，根据实验需要计算所需药品的量，用天平称取，加入适量蒸馏水溶解药品，混匀后用蒸馏水定容至目标体积，再将pH调至中性，分装培养基，0.101 MPa压力条件下灭菌30 min。NA/NB培养基配方如下：

NA固体培养基：蛋白胨：10.0 g/L；牛肉浸膏：3.0 g/L；氯化钠：5.0 g/L；琼脂：10 g/L；pH：7.2 ± 0.2；25℃；

NB液体培养基：蛋白胨：10.0 g/L；牛肉浸膏：3.0 g/L；氯化钠：5.0 g/L；pH：7.2 ± 0.2；25℃。

在培养皿中倒入NA固体培养基，吸取200 μL雷尔氏青枯菌菌悬液(OD₆₀₀≈ 1.0)均匀涂布至培养基表面。使用灭菌枪头打孔后垂直加入40 μL待测药剂(以药物溶剂作为对照)，按照如下公式计算待测药剂的抑菌效果。

$IR\left(\%\right)=\frac{r_0-r}{r_0-2.5}\times 100$(1)

式中r₀为药剂组菌落半径，r为对照组菌落半径。

采用高效液相色谱分离抑菌物质。设定色谱条件，使用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；设计流动相A相为色谱级甲醇，检测波长为300 nm，柱温为38℃；设置洗脱程序，采用等度洗脱的方式，设定流速为1.0 mL/min。采用平板对峙法验证各个物质的抑菌能力。

对具有较强抑菌效果的物质使用核磁共振仪鉴定物质种类，结合核磁氢谱、碳谱、二维谱分析结果鉴定化合物结构以验证。

取无菌96孔板置于超净工作台上，在样品测试组每孔加入100 μL菌悬液和100 μL不同浓度的青枯雷尔氏菌抑菌液，阳性对照组每孔加入100 μL菌悬液和100 μL的无水甲醇溶液，空白对照组加入200 μL NB液体培养基。将96孔板以封口膜密封，于28℃条件下培养24 h，设定酶标仪在600 nm下测定各孔在不同时间段的吸光值。按照如下公式计算抑菌率：

$抑菌率=\left(1-\frac{测试组O{D}_{600}-MNK空白组O{D}_{600}}{生长组O{D}_{600}-培养基空白组O{D}_{600}}\right)\times 100\%$(2)

预先于96孔培养板中加入100 μL浓度为1 × 10⁸CFU/mL的青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)菌液，试验组加入100 μL的不同浓度青枯雷尔氏菌抑菌液，使其各孔的终浓度依次为12.5 mL/L，25 mL/L，50 mL/L，100 mL/L，设置空白对照(50 μL青枯雷尔氏菌菌悬浮液 + 150 μL营养肉汤)和阴性对照(50 μL青枯雷尔氏菌菌液 + 50 μL无水甲醇 + 100 μL营养肉汤)，37℃培养24 h，利用酶标仪测定OD₆₀₀值。

在Tans-Kersten等人 [13] 的研究基础上，进行了轻微的修改。高压灭菌含0.3%琼脂的NB液体培养基，待培养基冷却至50℃后，试验组加入抑菌液使其终浓度分别为12.5、6.125、3.125、1.256 mL/L，对照组加入等量的无水甲醇，空白对照组则为不含MNK的NB培养基，轻轻摇匀并倒入相同规格的平板，试验中为排除培养基体积所产生的误差，需将培养基在试管中配置(20 mL/管)。待培养基凝固以后，分别吸取2.5 μL浓度为1 × 10⁸CFU/mL的菌液接种至培养基表面，37℃温箱培养24 h，培养期间平板勿晃动，待培养结束后测量各菌落直径。

在杨姗姗等人的基础上 [14] ，对趋化实验方案进行修改。青枯菌采用NB液体培养基在28℃、180 rpm条件下培养12 h，6000 rpm离心5 min收集菌体，用等体积磷酸缓冲液(100 mmol/L，pH 7.0)重悬菌体。然后在内径为1 mm的灭菌毛细管中吸入不同浓度(0、1.56、3.13、6.25、12.5 mL/L)的青枯雷尔氏菌抑菌液，垂直放入含有青枯菌液的培养皿内，静置40 min，用注射器将毛细管内的液体移出，稀释为1 × 10⁻⁵后涂布于含有红四氮唑的NA固体平板上，30℃培养18 h后计数。每组处理3次重复，以无水甲醇为对照。

使用Peeters等人 [15] 描述的结晶紫染色法，对青枯菌生物膜形成进行了评估，进行了一些小的修改。将浓度为1 × 10⁸CFU/mL的雷尔氏青枯菌菌液按1%比例接种至含青枯雷尔氏菌抑菌液的NB液体培养基中，终浓度依次为100、50、25、12.5 mL/L。同时设置空白对照组阴性对照，充分混匀并吸取200 μL的混合液于无菌的96孔培养板中，每组均设3个重复孔，置于37℃温箱中培养24 h。待培养结束后，吸净孔中的液体，用无菌的PBS缓慢清洗3次后，置于温箱中晾干；待晾干后，每孔加入200 μL的甲醇溶液固定20 min，吸弃甲醇，室温晾干15 min；待干燥后，每孔加入1%结晶紫染液200 μL，染色30 min，弃去染液，用无菌水清洗3次，每孔200 μL，吸弃双蒸水后，轻甩培养板至其干燥。待完全干燥后，向各孔中加入200 μL的33%冰醋酸溶液并充分混匀，静置10 min后用酶标仪测定其OD₆₀₀值。

使用R软件(v 4.2.2)进行统计学分析。数据至少来自三次独立的测量，统计分析采用单因素方差分析，P值小于0.05被认为是统计学上显著的。

采用平板对执法验证甲醇提取液和水提取液的抑菌效果，结果如 图1 所示，发现两组对照组和水提取液抑菌圈半径均为2.5 mm (抑菌圈大小即孔径大小，2.5 mm)，而甲醇提取液的抑菌圈半径达到8 mm (8.45，7.95，9.15 mm)，说明水提取液没有拮抗效果，而甲醇提取液抑菌率达到了69.05%。说明鱼腥草叶片抑菌物质溶于甲醇，故后续实验以鱼腥草叶片的甲醇提取液进行实验。

对甲醇提取液进行HPLC分离结果表明，在前10 min内，共鉴定出11个色谱峰( 图2 )，将每个峰单独分离出验证各自的抑菌效果后，发现在3.298 min的单体化合物A溶液有较强的抑菌效果(抑菌圈半径为：10.10，9.17，12.11 mm，平均抑菌率>75%)。

对纯品化合物A使用Bruker AVIII-600核磁共振仪进行红外图谱鉴定物质种类，并结合核磁氢谱、质谱分析结果鉴定化合物结构以验证。

该化合物的1H-NMR谱中显示( 图3 )存在16个脂肪族亚甲基氢质子信号δH 2.39 (t, J = 7.3 Hz, 2H, H-3)，1.43 (p, J = 7.3 Hz, 2H, H-4)，1.26 ~ 1.19 (overlapped, 8H, H-5, 6, 7, 8)，1.26 ~ 1.19 (overlapped, 2H, H-9)，1.29 ~ 1.24 (overlapped, 2H, H-10)。

通过HSQC谱( 图4 )确定它们对应的碳信号分别为δc 42.71 (C-3)，23.23 (C-4)，28.94 - 28.61 (C-5, 6, 7, 8)，31.34 (C-9)，22.13 (C-10)；存在6个甲基氢质子信号δH 2.05 (s, 3H, H-1)，0.85 (t, J = 6.7 Hz, 3H, H-11)，通过HSQC谱确定它们对应的碳信号分别为δc 29.58 (C-1)，13.89 (C-11)。该化合物的13C-NMR谱显示( 图5 )还存在1个酮羰基信号δc 208.21 (C-2)。

根据 图6 可以看出，结合HMBC谱中( 图7 )H-1与C-2，C-3的相关信号，H-3与C-4，C-5的相关信号，H-11与C-9，C-10的相关信号，推断该化合物的结构如式一所示：

通过以上分析，猜测该物质为甲基正壬酮(Methyl Nonyl Ketone)，对甲基正壬酮标品进行液相分析发现，在相同程序的条件下，甲基正壬酮标准品的出峰时间与化合物A一致，故此，我们确定，单体化合物A为甲基正壬酮(Methyl Nonyl Ketone, MNK)。

采用96孔板技术评估青枯菌抑制剂对雷尔氏青枯菌生长的影响。实验结果如 图8 所示，随着培养时间的延长，经青枯菌抑制剂处理的雷尔氏青枯菌吸光值(OD₆₀₀)呈现显著下降趋势(ANOVA, P < 0.01)，表明青枯菌抑制剂对雷尔氏青枯菌的生长具有显著的抑制作用。尤其在培养4小时后，抑制剂显著抑制了细菌的生长，而对照组的OD值基本保持不变。方差分析(ANOVA)进一步证实，培养24小时后，不同浓度的青枯菌抑制剂处理组与对照组相比，吸光值的下降具有显著统计学差异(P < 0.01)，进一步验证了青枯菌抑制剂浓度对雷尔氏青枯菌生长的影响。

采用微量二倍稀释法测定了青枯菌抑制剂对雷尔氏青枯菌的最小抑菌浓度，实验重复3次，按照公式(1)计算MNK抑菌率：

按照抑菌率的计算公式，分别计算抑菌液在不同浓度下的抑制效果，结果如下 表1 所示。

使用GraphPad Prism 8软件对MNK的抑菌效果进行拟合，计算IC₅₀(菌体生长抑制率为50%时的药物浓度)。

通过软件拟合的方程如下：

$y=4.5\ln \left(x\right)+43.89$(3)

其中x为药物浓度(mL/L)，y为抑菌率(%)。

通过GraphPad Prism 8软件计算，得出IC₅₀= 3.883 mL/L，抑菌液浓度达到3.883 mL/L时，药物对雷尔氏青枯菌的抑制效果达到50%。

进一步研究了青枯菌抑制剂对雷尔氏青枯菌运动性的影响。结果显示( 图9 )，经过24小时恒温培养后，青枯菌抑制剂显著降低了雷尔氏青枯菌的运动能力。随着抑菌剂浓度的增加，R. solanacearum迁移区的直径逐渐减小。尤其当抑菌剂浓度达到3.125 mL/L时，R. solanacearum的迁移区域直径明显缩小，而在6.125~12.5 mL/L范围内，未观察到明显差异。

细菌会趋向有利化学物质而规避有害化学物质，有效的药物抑制剂不仅能抑制青枯菌的生长，还能改变R. solanacearum的分布，影响微生态的群落组成及时空分布。与对照组相比，药物处理后毛细血管中R. solanacearum的数量均下降( 图10 )，当浓度达到6.25 mL/L时，细菌数量显著降低(ANOVA, P < 0.05)，药物对R. solanacearum趋化作用的影响，说明了药物抑制剂具有影响微生态组成结构的可能，从而多方面抑制R. solanacearum。

在0、12.5、25、50、100 mL/L的药物抑制剂浓度影响下，培养24 h后检查R. solanacearum的生物膜发展情况，结果如 表2 所示，相较于对照组，药物抑制剂分别在不同程度上增加了生物膜的形成。具体来说，当药物抑制剂浓度为12.5 mL/L、25 mL/L、50 mL/L、100 mL/L时，各自提高了雷尔氏青枯菌1.69%、3.96%、13.80%、64.45%的生物膜形成能力。这些发现表明，药物抑制剂促进了R. solanacearum生物膜的形成，使得R. solanacearum形成生物膜保护自身。