Cloning and Expression Analysis of Sox9a Gene in Hippocampus erectus
Sox9 plays an important role in gonadal differentiation and testis development in vertebrates. In order to explore the molecular characteristics and expression pattern of sox9a in Hippocampus erectus, RACE was used to obtain its full length cDNA of 1979 bp, including 339 bp 5’UTR, 1488 bp ORF and 152 bp 3’UTR, encoding a total of 496 amino acids. Multiple amino acid comparisons showed that the Hippocampus erectus sox9 had a highly conserved HMG-box domain. Phylogenetic tree analysis showed that it was most closely related to Hippocampus zosterae sox9a. RT-qPCR showed that sox9a was ubiquitously expressed in the main tissues of Hippocampus erectus adults, and showed a significant male preference in the gonads and was highly expressed in the testis, suggesting that sox9a might be involved in the differentiation and maintenance of Hippocampus erectus testis. This study laid a foundation for further research on the role of Hippocampus erectus sox9a in sexual development.
Hippocampus erectus
迄今为止,sox9基因已在不同物种中得到了广泛的研究。哺乳动物中,sox9基因高表达于生殖嵴的支持细胞中
线纹海马隶属海龙科海马属,原产于美洲地区加勒比海等海域
本实验所用的线纹海马购买于福建英特森公司,置于循环水箱中饲养。饲养水温24℃~26℃,盐度35‰,每日定时投喂两次,以鲜活糠虾和卤虫为主,饲养至6月龄时解剖。依次取雌雄线纹海马(各三尾)的脑、眼、鳃、心脏、肝脏、肾脏、肠道、皮肤、肌肉、卵巢、精巢和育儿袋,所有组织均经液氮速冻后置于−80℃超低温冰箱备用。
本实验采用TaKaRaMiniBEST Universal RNA Extraction Kit试剂盒的方法提取线纹海马雌雄各组织的总RNA,具步骤按照试剂盒说明书进行;使用微型分光光度计(NanoPhotometer-N50)和1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的浓度与质量。以提取的各组织RNA为模版,按照赛默飞公司提供的反转录试剂盒Scientific Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit的操作步骤进行cDNA的合成。
根据本实验室转录组sox9a基因的测序结果,在ORF内设计一对引物,以精巢和卵巢混合cDNA作为PCR反应的扩增模版,克隆sox9a基因的中间片段,PCR反应程序为:98℃ 30s;98℃ 10 s,56℃ 30 s,72℃ 2 min,(34个循环) 72℃ 5 min,4℃。
根据所获得的中间片段在5’端和3’端设计特异性引物;按照SMARTer RACE 5′/3′ Kit (TaKaRa)说明书,以线纹海马的性腺组织总RNA为模版合成5’ RACE和3’RACE cDNA的第一条链,结合RACE中自带的接头特异引物,遵循touchdowen巢式PCR扩增原则,进行sox9a基因5’UTR和3’UTR片段的克隆,PCR反应程序如下:98℃ 30 s;6个循环:98℃ 10 s,68~58℃ 30 s (−2 ℃/cycle),72℃ 2 min;27个循环:98℃ 10 s,56℃ 30 s,72℃ 2 min;72℃ 5 min,4℃。
以上所有PCR产物均经电泳切胶回收,连接到pmd-18t载体(TaKaRa)上并转化至大肠杆菌DH5α (Solarbio)中进行筛克隆,经PCR验证后挑选阳性菌落送测序比对。实验所用引物如
利用Expasy在线网站(
引物名称 |
序列(5’~3’) |
用途 |
sox9a race-f1 |
CTCAGCACAGGACCCAGATCAAGAC |
RACE扩增 |
sox9a race-f2 |
GCCTCTACTCGACTTTCAGCTACA |
|
sox9a race-r1 |
GTACTTGTAGTCGGGGTGATCCT |
|
sox9a race-r2 |
CGGGGAACTTATCGTCTTCGTCCTT |
续表
sox9a-F |
CACGCGTTCTGGGATTCTAT |
中间片段 扩增 荧光定量 内参基因 |
sox9a-R |
TCTGGTGAGCTGTGTGTAAACC |
|
Y sox9a F Y sox9a R actin F actin R |
CACGCGTTCTGGGATTCTAT TCTGGTGAGCTGTGTGTAAACC GGGACCTGACTGACTACCTC TCATACTCCTGCTTGCTGAT |
根据sox9a基因的cDNA序列设计荧光定量引物(
通过RACE扩增共获得Sox9a基因的cDNA全长1979 bp,包含5’ UTR339 bp、ORF 1488 bp和3’ UTR 152 bp,共编码496氨基酸,3’UTR具有典型的ploy A结构(
将线纹海马与其他物种sox9的氨基酸序列进行比对,结果显示所有序列均含有高度保守的HMG结构域,线纹海马的HMG-box位于105~180位氨基酸,另21~96位为sox-N二聚化结构域。其中,HMG-box结构域的两端存在两个独立的核定位信号NLS1、NLS2以及一个特征性基序,在HMG-box结构域的中心存在一个核输出信号NES (
物种 |
登录号 |
Sox9a序列比对 |
Human sapiens sox9 |
NG_012490.1 |
74.56% |
Mus musculus sox9 |
NC_000077.7 |
75.58% |
Gallus gallus sox9 |
NC_052549.1 |
81.87% |
续表
Xenopus tropicalis sox9 |
NC_030686.1 |
82.70% |
Oryziaslatipes sox9a |
NC_019866.2 |
74.74% |
Danio rerio sox9a |
NC_007123.7 |
77.82% |
Hippocampus comes sox9 |
XP_019714069.1 |
98.79% |
Hippocampus zosterae sox9a |
NW_026061305.1XP_04961477.1 |
98.79% |
Syngnathus acus sox9a |
XP_057682747.1 |
96.97% |
Corythoichthys intestinalis sox9a |
97.37% |
注:物种从上到下依次为人、小鼠、鸡、非洲爪蟾、青鳉、斑马鱼、线纹海马、虎尾海马、侏儒海马、尖海龙、内冠海龙。
系统进化树分析显示,斑马鱼的sox9b在早期便和其它物种的sox9发生了歧化,线纹海马的sox9a与哺乳动物、鸡、非洲爪蟾的sox9、模式鱼类斑马鱼和青鳉以及其它海龙科鱼类的sox9a聚为了一大支,其中与侏儒海马和虎尾海马的亲缘关系最近(
采用RT-qPCR检测sox9a在成年雌、雄线纹海马各个组织中的基因表达量,结果显示,sox9a在雌、雄线纹海马的大多组织中呈泛在表达,其中在雌雄海马的肝脏中富集程度最高,脑、眼、鳃次之。对雌雄组织进行比较发现,sox9a在雄性组织腮、心脏和性腺中的表达量均高于雌性(fold > 2),性腺中sox9a更是呈显著的性别二态性表达,其在精巢中的表达量是卵巢的33倍(
本研究通过RACE法克隆得到cDNA全长为1979 bp的sox9a基因序列,包含1488 bp的开放阅读框,编码496个氨基酸,通过同源性比对发现,其与鱼类、两栖类、鸟类和哺乳类均有较高的相似性且HMG-box结构域都高度保守。研究发现sox9a基因具有典型的sox9结构特征,其HMG结构域的两端存在两个独立的核定位信号NLS1、NLS2以及一个特征性基序(AQAARRKL),在HMG结构域的中心存在一个核输出信号NES,这与NCBI数据库中其他物种的sox9蛋白序列结构高度一致
硬骨鱼类的性别决定机制及其复杂,有研究表明sox9基因在鱼类的性别决定与分化过程中起着关键作用
在本研究中,克隆到一种sox9a基因,通过RT-qPCR发现其在各个组织中泛在表达,其中在精巢中的表达量远高于卵巢,呈现出明显的性别二态性,这与金钱鱼、大黄鱼、虹鳟等鱼类
综上所述,本研究通过RACE法成功克隆线纹海马的sox9a基因,RT-qPCR结果表明sox9a基因可能参与精巢和神经系统的发育等过程,与雄性性腺的性别决定与分化紧密相关,本研究为日后深入探究线纹海马的性别发育机制提供参考资料。