本课题使用的植物为天山橐吾(Ligularia narynensis)，于2020年7月采自于新疆，经青海师范大学确生教授鉴定为菊科橐吾属植物天山橐吾，植物标本存放于兰州交通大学六号实验楼517。

(1) 主要仪器

本实验中所用到的主要仪器及生产厂家见 表1 。

续表

(2) 主要试剂

本实验中所用到的所用试剂均为分析纯、色谱纯，具体试剂材料及生产厂家见 表2 。

培养基的配制：

① LB液体培养基：牛肉膏蛋白胨液体培养基：氯化钠10 g，蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，蒸馏水1000 mL，调节pH至7.4，高压灭菌锅121℃灭菌30 min，4℃冰箱保存待用；

② LB固体培养基：向配置好的液体培养基中，再添20 g琼脂，121℃灭菌30 min，即得到固体培养基；

③ PDA培养基：去皮马铃薯200 g，加热煮沸30 min，用八层纱布过滤除去不溶物，加入20 g葡萄糖，20 g琼脂，即得到PDA培养基。

(3) 实验菌株

本实验所使用的供试病原菌菌株均由兰州交通大学天然药物研究所提供，具体实验菌株见 表3 。

菌悬液的制备：

用接种环将待测菌种接种到液体培养基中，在摇床上培养至对数期，将细菌配制成菌液浓度为10⁶~10⁷CFU/mL，真菌配制成10⁶~10⁷CFU/mL的孢子悬浮液。

(1) 提取方法

提取挥发油的方法很多，传统方法如水蒸气蒸馏法、溶剂萃取法、冷压法等，现代方法如CO₂超临界流体萃取、酶提取法、微波辐射法、超声波辅助提取等。水蒸气蒸馏法是提取植物性天然香料最经典的一种方法。根据橐吾属植物挥发油提取的相关文献，本实验采用水蒸气蒸馏法。称取天山橐吾全草粉末100 g，装入1000 ml的圆底烧瓶，加入400 ml蒸馏水浸泡12 h [6] 。参照2010年版《中华人民共和国药典》，水蒸气蒸馏法提取8 h，然后冷却至室温，用乙醚萃取馏出液的水相3次，分别处理馏出液油状物与萃取液，用无水硫酸钠干燥，过滤，环己烷清洗，旋转蒸发仪将其减压浓缩后，转移至西林瓶中避光保存，做好标记。天山橐吾挥发油是具有特殊气味的淡黄色油状液体。

(2) 气相色谱–质谱分析条件

气相色谱–质谱联用技术(GC-MS)同时具有气相色谱的强分离能力和质谱对未知化合物的高鉴定能力，是医药卫生、食品、环境等各领域中分离和检测复杂挥发性成分的重要工具 [7] [8] 。

气相色谱条件：GC-MS接口温度为230℃，柱温程序为60℃保持1分钟，并以2.5℃/min的速率升高至210℃，保持5分钟，然后以10℃/min速率升至280℃并保持1分钟。以氦气作为载气的流速为1.2 mL/min，进样量0.2 μL。

质谱条件：EI离子源，离子源温度为230℃，电离电压是70 eV。

(3) 挥发油GC-MS成分分析结果

采取水蒸气蒸馏法提取天山橐吾的挥发油，得到具有特殊气味的淡黄色液0.198 g，出油率是0.198%。天山橐吾的挥发油经GC-MS分析，共得到了22个化合物，其中大多为倍半萜类成分。以上分析结果与橐吾属植物中主要成分是倍半萜类化合物这一规律相吻合。将GC-MS分析后的质谱图通过NIST谱图库并核对相关文献确定其化学组成，绘制成 表4 。

续表

挥发油的抗菌实验一般采用琼脂扩散法–滤纸片法及MTT法。滤纸片法是通过抑菌圈的直径大小来直接衡量挥发油的抗菌活性，此法操作简便、结果直观。MTT法是间接的反映药物对细胞的抑制作用，再根据颜色深浅通过酶标仪测定吸光度值，即二甲亚砜(DMSO)溶解活细胞中由琥珀酸脱氢酶将淡黄色的MTT还原成水不溶性的蓝紫色结晶甲臜。MTT法还经常被用于微生物的抑菌率测定。本实验采用更简单、便于观察的滤纸片法来测定天山橐吾挥发油的抑菌活性。

(1) 实验方法

从灭菌锅中取出PDA固体培养基的锥形瓶，降温至50℃左右，在超净台中倒入直径为9 cm的培养皿，每个培养皿约20 ml，待凝固后，用移液枪取200 l稀释后的菌液，用涂布棒涂布均匀。将活化好的植物病原真菌菌株用打孔器制成直径为6 mm的菌饼，并用无菌接种针倒扣放置在PDA平板的中心。用无菌镊子夹取已灭菌的直径6 mm的无菌滤纸片，每块平板上对称放置2张滤纸片，使用移液枪吸取20 μL的天山橐吾挥发油(1 mg/ml)滴加至滤纸片上，另一个滤纸片加20 μL的二甲基亚砜做空白对照，每个样品设置3个平行实验。将培养皿置于37℃培养箱中培养18~24 h，根据抑菌圈的大小评估抑菌活性的强弱。每个样品设置3个平行实验。

(2) 实验结果

注：表中，抑菌圈直径：<10 mm (−)，10~12 mm (+)，13~15 mm (++)，16~20 mm (+++)。

在药物浓度为1 mg/ml时，天山橐吾挥发油仅对金黄色葡萄球菌有微弱的抑菌作用，对于枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和其他植物病原真菌，均无明显抑菌活性，实验结果见 表5 。