Construction and Transformation of the GUS Expression Vector Driven by the Rice OsTLP12 Gene Promoter
Plant thaumatin-like proteins (TLPs) are involved not only in host defense against fungal invasion but also in defense against abiotic stresses. In this experiment, the upstream 2000 bp promoter fragment of the OsTLP12 gene was cloned from Oryza sativa ‘Nipponbare’ using PCR technology, and the cis-acting elements contained therein were analyzed. Subsequently, a fusion expression vector containing the GUS reporter gene was constructed, and the fusion expression vector was introduced into rice via Agrobacterium-mediated transformation. The transformed plants were then screened, and GUS staining analysis was performed on the transgenic plants. The following results were obtained: 1) The promoter fragment of the OsTLP12 gene in rice was successfully cloned, and it was fused with the expression vector containing the GUS reporter gene to obtain the fusion expression vector; 2) The promoter region of the OsTLP12 gene contains multiple cis-acting elements related to biotic and abiotic stress responses; 3) The fusion expression vector was successfully transformed into rice, and positive transgenic seedlings were screened out; 4) GUS staining was performed on transgenic seedlings to detect the expression driven by the OsTLP12 gene promoter.
Rice
Thaumatin蛋白源自西非植物Thaumatococcus daniellii,具有甜味,因此也称为甜蛋白
大量的转基因过表达、体外抗真菌活性测试以及相关蛋白活性分析提供了越来越多的证据,支持TLPs在宿主防御和其他生理过程中的作用。例如,一种名为PR-NP24的TLP在番茄外果皮中表达具有特异性,在受NaCl处理诱导时其积累增加,从而增强植物对入侵真菌病原体的抗性
尽管对TLP蛋白功能的研究日益增多,但其作用机制仍知之甚少。为了进一步探究和解析特青籼稻中OsTLP12的功能和作用机制,本研究成功克隆了OsTLP12TQ的起始密码子上游1985 bp的启动子区域,并对其顺式作用元件进行了分析。同时,构建了启动子与GUS标记基因的融合表达载体,将融合载体转化进入水稻中,为研究OsTLP12TQ的表达模式奠定了基础。
籼稻品种特青(Oryza sativa subsp. Indica cv. TQ),含有GUS标记基因的表达载体DX2181-eGFP (由湖南农业大学作物基因工程湖南省重点实验室提供),大肠杆菌菌株:DH5α (购自北京擎科生物科技有限公司)。EHA105农杆菌感受态细胞(武汉伯远生物科技有限公司)。
高保真酶TransStartFastPfu DNA Polymerase、质粒提取试剂盒Plasmid MiniPrep Kit购自北京全式金生物技术股份有限公司。限制性内切酶FastDigest购自赛默飞世尔科技(中国)公司。同源重组酶(SoSoo Cloning Kit)、DNA凝胶回收试剂盒购自北京擎科生物科技有限公司。引物合成由北京擎科生物科技有限公司完成,测序由上海生工生物工程股份有限公司完成。
为克隆OsTLP12TQ基因的启动子片段,在NCBI数据库中根据日本晴(以下简称为NPB)中Os12g0630100起始密码子上游2000 bp序列分别设计正向克隆引物pTLP12-GUS-F和反向克隆引物pTLP12-GUS-R,在引物前端加上含有BamHⅠ酶切位点的DX2181-eGFP载体的同源臂序列,引物序列:pTLP12-GUS-F,tggctgcaggtcgacggatccCCGGTCTGACCGGCCAC;pTLP12-GUS-R,ggactgaccacccggggatccTGTTGCTTGCTTTCTTCTAATCTTTG (小写字母为同源臂序列)。以籼稻品种TQ基因组DNA为模板,使用TransStartFastPfu DNA聚合酶配制PCR扩增体系(20 μl):5 × TransStart FastPfu Buffer 4 μl,dNTPs (2.5 Mm/L)1.6 μl,DNA Polymerase 0.4 μl,pTLP12-GUS-F和pTLP12-GUS-R (10 μmol/L)各0.5 μl,模板DNA 2 μl,无菌去离子水补充至20 μl。PCR反应程序为:95℃预变性5 min;95℃变性20 s,60℃退火20 s,72℃延伸60s,31个循环,72℃终延伸5 min。反应结束后使用1%琼脂糖凝胶电泳(120 V, 20 min)。选择大小为2000 bp的单一片段使用DNA凝胶回收试剂盒纯化。
将DX2181-eGFP质粒进行单酶切,选用BamHI作为酶切位点,并配置酶切反应体系(总体积10 μl):DX2181-eGFP质粒DNA 5 μl,10 × CutSmart缓冲液1 μl,BamHⅠ内切酶1 μl,无菌去离子水补至10 μl,37℃反应3小时。反应结束后进行1%琼脂糖凝胶电泳(120V,20分钟),使用DNA凝胶回收试剂盒纯化线性载体。接着使用同源重组酶连接线性质粒和目的片段,连接反应体系为:线性化载体DX2181-eGFP 3 μl,启动子片段7 μl,50℃反应20分钟。将连接产物转化至大肠杆菌感受态DH5α,使用含有Kanamycin的LB培养基过夜培养。挑取阳性单克隆菌落,进行PCR鉴定(参考步骤2.2.1),摇菌,提取质粒。进行酶切验证,并将样品送至生工生物公司进行测序验证。验证结果为正确的重组质粒命名为pTLP12::GUS。
对测序后的OsTLP12TQ启动子序列与NCBI数据库中的OsTLP12NPB序列比对,并利用PlantCARE数据库分析其顺式作用元件。
通过电转法将pTLP12::GUS质粒转入到EHA105农杆菌感受态细胞中,将转化液置于含卡那霉素的培养基中培养(50 mg/L),利用PCR反应来检测质粒转入情况。挑取阳性农杆菌于侵染液中,制备重悬液,挑取诱导的愈伤于农杆菌重悬液,侵染10~15 min。筛选单克隆愈伤组织,将阳性愈伤接种至分化培养基。待分化出2~5cm的芽后接种至生根培养基,30℃光照培养7~10天。
收获T0代种子,种植于含潮霉素(50 mg/L)的1/2MS培养基上,取培养至一心期幼苗置于GUS染液(50 Mm pH7.0的磷酸钾缓冲液、10 mM Na2-EDTA、0.1% Triton X-100、1mg/mlX-Gluc、100 μg/ml氯霉素、1 mM的铁氰化钾、1mM的亚铁氰化钾及20%的甲醇)中,37℃避光过夜。用95%乙醇脱色,然后拍照记录。
根据日本晴基因组序列设计扩增OsTLP12TQ启动子的特异性引物,以籼稻特青基因组DNA为模板进行PCR反应,最终获得一条长为2000 bp的片段(
顺式元件 |
基序(5’-3’) |
位置 |
数量 |
功能 |
ABRE |
ACGTG |
874+、1735+、1638+ |
3 |
参与脱落酸反应 |
ARE |
AAACCA |
273+ |
1 |
参与厌氧诱导 |
AT-rich element |
ATAGAAATCAA |
1479− |
1 |
DNA结合蛋白(ATBP-1)的结合位点 |
CAAT-box |
CCAATT |
1036+、1375+、1661−、1698+ |
4 |
启动子和增强子区域 |
CAAAT |
318−、965+…… |
9 |
||
CGTCA-motif |
CGTCA |
321−、324+、783+、389− |
4 |
参与茉莉酸甲酯反应 |
G-box |
TACGTG |
1734+、1673+、873+ |
3 |
参与光反应 |
CACGAC |
1087− |
1 |
||
TAACACGTAG |
94− |
1 |
||
HD-Zip 1 |
CAAT (A/T) ATTG |
1153− |
1 |
参与叶肉栅栏组织分化的元件 |
GT1-motif |
GGTTAA |
1518−、803+ |
2 |
光响应元件 |
GGTTAAT |
668+ |
1 |
||
MBS |
CAACTG |
1459+ |
1 |
与干旱诱导有关的MYB结合位点 |
O2-site |
GATGATGTGG |
257− |
1 |
参与玉米醇溶蛋白代谢调节 |
GATGA(C/T)(A/G)TG(A/G) |
1623+ |
1 |
||
GTTGACGTGA |
321− |
1 |
||
RY-element |
CATGCATG |
661+、1430− |
2 |
参与种子特异性调节 |
TATA-box |
TATATA |
1899+、181+、1901−、1945−、279+、507+ |
6 |
转录开始的−30 bp左右的核心启动子元件 |
ATATAA |
181+、508+、438+、751+、437+、656− |
6 |
||
ATATAT |
903+…… |
9 |
||
TACAAAA |
954+、955+、957+、1141+ |
4 |
||
TATA |
1142−、1167−…… |
19 |
||
TATACA |
1559−、182+ |
2 |
||
TATAA |
1276− |
1 |
||
TCTATAAATAGG |
1899+ |
1 |
||
W-box |
TTGACC |
204−、562+ |
2 |
WRKY蛋白结合位点 |
通过电转法将重组质粒转入农杆菌细胞中,利用PCR来检测转入情况,结果如
构建启动子-GUS表达载体是研究基因启动子功能和调控机制的重要工具,有助于深入理解基因的调控网络和生物学功能。通过将目标基因启动子与GUS基因结合,可以在植物细胞中表达GUS报告基因,从而研究基因启动子的活性和调控机制
本研究成功克隆了水稻中类甜蛋白OsTLP12基因的启动子并构建了相应的GUS表达载体,通过酶切验证和序列分析,确保了构建的表达载体的准确性和稳定性,这为进一步的转基因植物研究奠定了基础。对OsTLP12基因启动子的结构和功能进行了初步分析,发现其中具有多个生物和非生物逆境反应相关顺式元件。并为进一步研究该基因在水稻生长发育过程中的调控机制提供了基础。通过序列比对和分析,确认了所克隆启动子的一致性和完整性。这为后续的功能研究提供了可靠的实验材料。GUS染色结果显示,本研究成功构建了OsTLP12基因启动子GUS表达载体及转基因材料,在转基因材料中,根及胚芽鞘有较强的表达,说明OsTLP12可能在水稻种子发芽时具有重要作用,但对其在水稻生长发育中的具体调控机制仍需进一步深入的研究。总的来说,本研究为进一步探究水稻中类甜蛋白OsTLP12基因的功能和调控机制提供了重要的实验基础,也为水稻品种改良和生产提供了潜在的应用价值。
本研究获得了国家自然科学基金的资助(32172088)。
*第一作者。
#通讯作者。