实验选取纯棉、麻布、涤棉布、聚酯纤维(涤纶)、尼龙、牛仔布六种布料作为填料载体，进行挂膜性能测试。挂膜粘合剂选用琼脂，将填料裁成等面积大小(10 * 10 cm，100 cm²)，浸入加热融化的20 g/L琼脂溶液中，充分浸润后取出，自然冷却形成挂膜。挂膜后通过挂膜量和耐用性评估不同材质的挂膜性能。

MBBR反应器装置的长、宽、高分别为20 cm、20 cm和15 cm，有效容积为5 L ( 图1 )。装置通过底部进水口进水，上部出水口出水，进出水流速由蠕动泵控制，保证反应器内水体交换。曝气管安装在装置底部，提供微生物降解污染物所需的溶解氧。在每个反应器内侧卡槽内固定6块填料载体，确保其不存在折叠、脱落现象。填料载体为已固定包埋硝化反硝化细菌的布料(尺寸18 * 15 cm)。

设置R1、R2、R3三个反应器。R1、R2为实验组，R3作为对照组，固定化包埋载体的菌悬液分别为40 mL，80 mL，0 ML，每个反应器固定6块填料载体。实验进水采用人工模拟水产养殖废水，养殖废水的初始COD浓度为110 mg/L、氨氮浓度为5 mg/L、硝氮浓度为5.2 mg/L、总氮浓度为10.8 mg/L，具体成分见 表1 。反应器分三阶段连续运行30 d，试验运行工况见 表2 。

载体填料上的固定化包埋菌株为具有好氧硝化反硝化能力的不动杆菌属(Acinetobacter sp.) S1菌株和假单胞菌属(Pseudomonas sp.) W5菌株。将S1和W5菌株分别在牛肉膏蛋白胨培养液中35℃摇床培养48 h，各取300 mL培养液离心，弃去上清液，再加入纯水定容至100 mL，获得S1和W5的浓缩菌悬液各100 mL。取等量S1和W5浓缩菌悬液搅拌加入融化的20 g/L琼脂溶液中，再将裁好的布料放入至布料充分浸润后取出，自然冷却形成挂膜，获得40 mL包埋菌量的固定化包埋载体填料。80 mL菌悬液的固定化包埋载体填料则含有S1和W5浓缩菌悬液各40 mL。

在反应器运行30d第三阶段结束时，刮取填料及附着在填料表面的生物膜，测定微生物群落结构。本实验采用高通量测序对生物膜中细菌群落进行检测。首先从不同样品中提取DNA，利用1%的琼脂糖凝胶电泳检测提抽的基因组DNA。再进行PCR扩增，所有PCR反应均使用TransGen AP221-02: TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20 μl反应体系进行。扩增选择区域为16S rRNA V3-V4区。341F (CCTAYGGGRBGCASCAG)和806R (GGACTACNNGGGTATTCTAAT)引物用于进行扩增。每个样本3个重复，将同一样本的PCR产物混合后进行电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物，Tris_HCI洗脱；2%琼脂糖电泳检测。参照电泳初步定量结果，将PCR产物用QuantiFluor^TM-ST蓝色荧光定量系统(Promege公司)进行检测定量，之后按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。随后，所有PCR序列纯化后均使用illumina公司的MiSeq PE300进行扩增，试剂采用TruSeqTM DNA Sample Prep Kit。纯化和测序均由上海美吉生物医药科技有限公司(Shanghai Majorbio Bio-pharm Technology Co., Ltd)完成。利用Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)将纯化的16S rDNA 基因序列与GenBank中现有的16S rDNA基因序列进行比较。

在MBBR实验装置连续进水的第1天开始，定期对进出水取样，水样经0.45 μm滤膜过滤后，测定氨氮( $N{H}_4^{+}\text{-}N$)、亚硝态氮( $N{O}_2^{-}\text{-}N$)、硝态氮( $N{O}_3^{-}\text{-}N$)、总氮(TN)、化学需氧量(COD)等水质参数。水质测定方法参考国家环保总局《水和废水监测分析方法》 [10] 。

如 表3 所示，棉布、麻布、涤棉布、牛仔布相对聚酯纤维、尼龙布挂膜量较多，因其粗糙程度相对较大，故而挂膜量大，且孔隙率较大，缝隙中夹杂的微生物含量大。此外，涤棉布在干、湿情况下弹性和耐磨性都较好，伸展性也较好，尺寸稳定。结合各项性能综合考虑，最终确定挂膜填料为涤棉，以此进一步开展后续实验。

如 图2(a) 所示，HRT和包埋菌量能够影响COD的去除效率。在HRT为12 h时，包埋菌实验组R1、R2 COD的去除率分别为21.00%、30.24%；在HRT为10 h时，R1、R2 COD的去除率分别为41.29%、51.79%；在HRT为8 h时，R1、R2 COD的去除率分别为64.91%、71.74%。而对照组R3在12 h、10 h、8 h的COD去除率分别为10.52%、26.11%、32.74%。结果表明，包埋菌量越多，HTR越短，COD去除效果越好。

HRT和包埋菌量也能够显著影响 $N{H}_4^{+}\text{-}N$、 $N{O}_3^{-}\text{-}N$、TN去除率和 $N{O}_2^{-}\text{-}N$积累量。如 图2(b)~(e) 所示，第一阶段HRT = 12 h时，包埋菌实验组R1、R2的 $N{H}_4^{+}\text{-}N$平均去除率分别为85.04%、90.12%， $N{O}_3^{-}\text{-}N$的平均去除率分别为62.81%、71.35%；TN的平均去除率分别为73.91%、79.45%； $N{O}_2^{-}\text{-}N$的平均积累量分别为0.18 mg/L、0.24 mg/L。第二阶段HRT = 10 h时，实验组R1、R2的 $N{H}_4^{+}\text{-}N$平均去除率分别为90.72%、95.16%， $N{O}_3^{-}\text{-}N$的平均去除率分别为74.33%、83.83%；TN的平均去除率分别为81.87%、88.29%； $N{O}_2^{-}\text{-}N$的平均积累量分别为0.16 mg/L、0.18 mg/L；第三阶段HRT = 8 h时，实验组R1、R2的 $N{H}_4^{+}\text{-}N$平均去除率分别为96.88%、98.94%， $N{O}_3^{-}\text{-}N$的平均去除率分别为88.94%、94.46%；TN的平均去除率分别为92.31%、95.81%； $N{O}_2^{-}\text{-}N$的平均积累量分别为0.10 mg/L、0.11 mg/L。与未加固定化硝化反硝化菌对照组相比，加菌实验组对 $N{H}_4^{+}\text{-}N$、 $N{O}_3^{-}\text{-}N$、TN的去除率更高， $N{O}_2^{-}\text{-}N$的积累量则没有显著差别。

综上所述，反应器在投加菌量为80 ml，HRT为8 h时脱氮处理效果最好。水力停留时间HRT是影响生物脱氮的一个重要操作参数 [11] 。适宜的HRT能让微生物更好地适应营养物质和环境条件，但过高的水力停留时间虽能为复合菌群与养殖废水提供更长的接触时间，提高反应器脱氮效率，但长时间的停留会使有机碳源得不到及时补充，且造成底物浓度过高，从而使反应系统中的微生物产生竞争作用，且过高底物浓度对脱氮菌有抑制作用，从而导致HN-AD复合菌处于劣势地位，造成脱氮效果不佳的结果 [12] 。此外，提高投加硝化反硝化菌量使得反应器获得了更多的脱氮菌群细胞数量，从而提高反应器脱氮效率。

图2. 不同HRT和包埋菌量下的COD (a)、 $N{H}_4^{+}\text{-}N$(b)、 $N{O}_3^{-}\text{-}N$(c)、TN (d)去除率和 $N{O}_2^{-}\text{-}N$(e)积累量

对生物膜和处理水样的宏基因组序列分析结果见 图3 和 图4 。由 图3 可知，各反应器中鉴定出的门细菌主要有变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidota)、放线菌门(Actinobacteriota)、疣微菌门(Verrucomicrobiota)和厚壁菌门(Firmicutes)。Proteobacteria为各反应器中检测出的优势菌门，其相对丰度范围为87.32%~93.60%，Bacteroidota相对丰度仅次于Proteobacteria，占比为2.77%~8.00%。Proteobacteria和Bacteroidota广泛存在于城市污水处理系统中，在有机物降解和反硝化过程中起重要作用 [13] [14] [15] 。Bacteroidota是一种化能异养细菌，有利于促进含氮物质的利用、类固醇生物转化及水解大分子物质 [16] 。Actinobacteriota和Firmicutes，分别占0.35%~1.51%和0.067%~1.86%。Actinobacteriota分泌的细胞外酶，如几丁质酶、木质素酶、木聚糖和果胶酶等，能够有利于水体中有机物的降解 [17] 。

图4 是各样品微生物群落在属水平上的相对丰度变化。由 图4 可知，在属水平上，样品中相对丰度较高的属有固氮螺旋菌属(Azospirillum)、不动杆菌属(Acinetobacter)、鞘脂菌属(Sphingobium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、戴尔福特菌属(Delftia)、未分类肠杆菌(unclassified_f_Enterobacteriaceae)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、黄杆菌属(Flavobacterium)、申氏杆菌属(Shinella)、Variovorax (贪噬菌属)等。Acinetobacter和Pseudomonas丰度最高，Pseudomonas和Acinetobacter属典型HN-AD菌，具有较强异样硝化和好氧反硝化能力 [18] [19] 。

三个反应器的Pseudomonas和Acinetobacter丰度均较高，原因是自来水中这些菌本身属于优势菌，在含氮较高水中会大量繁殖的结果。此外，包埋假单胞菌属Pseudomonas sp. W5和不动杆菌属Acinetobacter sp. S1的琼脂载体表面出现一定程度的腐蚀水化，导致部分包埋细菌的脱落进入到反应器中繁殖是其另外一个来源。