目的：比较国内外不同检验领域中现行版本的白色念珠菌检查方法及标准的差异，为我国化妆品相关微生物标准的修订和完善提供参考。方法：比较中国药典、我国出入境检验检疫行业标准化妆品、出口食品中白色念珠菌检测方法(包括样品前处理、增菌、分离、鉴定等)的差异。结果与结论：不同检验体系中的微生物标准中虽然培养基体系不同，但同一种微生物特性不变，在鉴定时存在参考借鉴的可能。建议相互取长补短，从实验具体操作和实验思路拓展等方面提出可行性的参考方案，为《化妆品安全技术规范》中白色念珠菌检查法的修订提供参考，提高我国化妆品微生物控制水平，保障广大人民群众的用妆安全。 Objective: To compare the current methods and standards of Candida albicans in different testing fields at home and abroad, and to provide reference for the revision and improvement of the standards of cosmetics related microorganisms in China. Methods: The differences of detection methods of Candida albicans in cosmetics and export food were compared between Chinese pharmacopoeia and Chinese entry-exit inspection and quarantine industry standards, including sample pretreatment, bacteria enhancement, isolation and identification. Results and Conclusion: Although the medium system is different, the characteristics of the same microorganism are the same, and there is a possibility of reference in the identification. It is suggested to learn from each other’s strengths and weaknesses, and put forward a feasible reference scheme from the aspects of the specific operation of the experiment and the expansion of the experimental ideas, so as to provide a reference for the revision of the Candida albicans inspection method in the Technical Specification for Cosmetic Safety, improve the level of microbial control of cosmetics in China, and ensure the safety of the people.
目的：比较国内外不同检验领域中现行版本的白色念珠菌检查方法及标准的差异，为我国化妆品相关微生物标准的修订和完善提供参考。方法：比较中国药典、我国出入境检验检疫行业标准化妆品、出口食品中白色念珠菌检测方法(包括样品前处理、增菌、分离、鉴定等)的差异。结果与结论：不同检验体系中的微生物标准中虽然培养基体系不同，但同一种微生物特性不变，在鉴定时存在参考借鉴的可能。建议相互取长补短，从实验具体操作和实验思路拓展等方面提出可行性的参考方案，为《化妆品安全技术规范》中白色念珠菌检查法的修订提供参考，提高我国化妆品微生物控制水平，保障广大人民群众的用妆安全。
检验体系，白色念珠菌，检查方法，比较研究
Yanfei Zhong, Xiaomin Ling, Huanmin Zhu, Tiehao Lin
Guangdong Institute of Drug Control, Guangzhou Guangdong
Received: Apr. 23rd, 2024; accepted: May 22nd, 2024; published: May 30th, 2024
Objective: To compare the current methods and standards of Candida albicans in different testing fields at home and abroad, and to provide reference for the revision and improvement of the standards of cosmetics related microorganisms in China. Methods: The differences of detection methods of Candida albicans in cosmetics and export food were compared between Chinese pharmacopoeia and Chinese entry-exit inspection and quarantine industry standards, including sample pretreatment, bacteria enhancement, isolation and identification. Results and Conclusion: Although the medium system is different, the characteristics of the same microorganism are the same, and there is a possibility of reference in the identification. It is suggested to learn from each other’s strengths and weaknesses, and put forward a feasible reference scheme from the aspects of the specific operation of the experiment and the expansion of the experimental ideas, so as to provide a reference for the revision of the Candida albicans inspection method in the Technical Specification for Cosmetic Safety, improve the level of microbial control of cosmetics in China, and ensure the safety of the people.
Keywords:Inspection System, Candida albicans, Inspection Method, Comparative Study
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白色念珠菌(Candida albicans)又称白假丝酵母菌，是念珠菌属中最常见的一种条件致病菌，主要寄生在人的体表、口腔黏膜、呼吸道、消化道和泌尿生殖道等部位 [
| 适用产品 | 标准分类 | 检测项目 | 试验方法 | 备注 |
|---|---|---|---|---|
| 药品 | 国家标准 | 定性检测 | 《中国药典》2020年版四部通则1106非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法 | 方法一 |
| 食品 | 行业标准 | 定性检测 | 《SN/T 3970-2014出口食品中白色念珠菌检测方法》 | 方法二 |
| 化妆品 | 行业标准 | 定性检测 | 《SN/T 2206.8-2013化妆品微生物检验方法第8部分：白色念珠菌》 | 方法三 |
| 化妆品 | 国际标准 | 定性检测 | 《ISO 18416-2015 Detection of Candida albicans》 | 方法四 |
表1. 不同产品中白色念珠菌检查方法的比较
目前，白色念珠菌检查方法在不同产品方面也颁布了一些标准方法，这些标准方法包括SN/T 3970-2014出口食品中白色念珠菌检测方法 [
食品是一种商品，用于饱腹，提供能量、营养、支持生命活动。药品是一种特殊的商品，是指用于预防、治疗、诊断人的疾病，有目的地调节人的生理机能并规定有适应症或者功能主治、用法和用量的物质，包括中药、化学药和生物制品等 [
上述四种检验方法都是为了保障广大人民群众的产品安全，依据国家颁布的法律法规，在微生物实验室严格按照“人、机、料、法、环”的相应要求，进行标准化的检验操作。不论是药品、食品还是化妆品，检验对象都是微生物白色念珠菌，那么检验原理即是相同的，检测流程均按照供试液制备、增菌培养、选择和分离培养，鉴定以及结果判断几个环节展开。
方法一适用于药品，而且是特定给药途径的药品才需要检查白色念珠菌，属于国家标准。药品标准对样品的前处理方法有详细描述，药品的判定标准则在药品标准及通用检测方法中都有表述，药品的通用检测方法收录于药典四部通则 [
食品、药品和化妆品在标准及检验内容等方面有诸多不同，对于白色念珠菌检验的流程都是相同的，第一步是用非选择性增菌培养基对目标菌进行增菌培养，第二步是用选择性分离培养基对目标菌进行分离培养，最后对疑似菌进行鉴别试验，以下从实验过程的详细步骤对白色念珠菌检查方法的进行比较，详见表2。
严格的采样方案是根据检验目的、样品的特点、批量、检验方法、微生物的危害程度等方面因素来确定的，在此不作详细论述。微生物污染具有不均匀的特点，样品的采集应遵循随机性、代表性的原则 [
方法一是取规定量的样品按照《中国药典》2020年版四部通则1105微生物计数法采用适宜的方法 [
| 项目 | ChP2020四部通则1106 (方法一) | SN/T 3970-2014 (方法二) | SN/T 2206.8-2013 (方法三) | ISO 18416-2015 (E) (方法四) |
|---|---|---|---|---|
| 取样量 | 相当于1 g或1 mL 样品的供试液 | 25 g或25 mL样品 | 10 g或10 ml (不应少于1 g或1 mL)样品 | 至少1 g或1 mL样品 |
| 增菌培养 | 沙氏葡萄糖液体 培养基 30~35℃，3~5 d | 液体沙氏培养基 32.5℃± 2.5℃，48 h ± 2 h (必要时延长至72 h) | SCDLP液体培养基或Eugon LT100肉汤或液体大豆酪蛋白消化物培养基或改良letheen肉汤或GPLP80肉汤或D/E中和肉汤30℃ ± 1℃，20 h~72 h | Eugon LT100肉汤或液体大豆酪蛋白消化物培养基或改良letheen肉汤或GPLP80肉汤或D/E中和肉汤或SCDLP80肉汤32.5℃ ± 2.5℃，20 h~72 h |
| 分离培养 | 沙氏葡萄糖琼脂培养基30~35℃，24~48 h | TTC沙氏琼脂培养基 和念珠菌显色培养基32.5℃ ± 2.5℃， 48 h ± 2 h (必要时延长至72 h) | 沙氏葡萄糖氯霉素琼脂培养基或念珠菌显色培养基或含抗生素的马铃薯葡萄糖琼脂培养基 30℃ ± 1℃，24~48 h | 沙氏葡萄糖氯霉素琼脂培养基(或含氯霉素的马铃薯葡萄糖琼脂培养基) 32.5℃ ± 2.5℃，24~48 h |
| 鉴定 | 念珠菌显色培养基，24~48 h (必要时延长至72 h)或采用其他适宜方法进一步鉴定 | 1.革兰氏染色 2.芽管形成试验 3.厚膜孢子形成试验 | 1.革兰氏染色 2.芽管形成试验 3.厚膜孢子试验 | 1.革兰氏染色 2.芽管形成试验 3.厚膜孢子试验 |
| 标准菌株 | 白色念珠菌CMCC (F) 98001 | 未规定 | 白色念珠菌ATCC10231、热带 念珠菌ATCC750或等效菌株 | 白色念珠菌ATCC10231 或等效菌株 |
| 结果报告单位 | 1 g或1 mL | 25 g或25 mL | 10 g或10 mL | 1 g或1 mL |
表2. 各标准白色念珠菌检查方法的比较
方法一规定使用沙氏葡萄糖液体培养基作为增菌液，对于增菌液的体积不作规定，需要经方法适用性试验进行确定；方法二规定使用225 mL液体沙氏培养基作为增菌液，其固定体积与固定的取样量相关；方法三规定使用SCDLP液体培养基作为增菌液，同时推荐了其他增菌液，分别是Eugon LT100肉汤、液体大豆酪蛋白消化物培养基、改良letheen肉汤、添加卵磷脂–吐温80的葡萄糖和蛋白胨培养基(GPLP80肉汤)、D/E中和肉汤；方法四规定使用Eugon LT100肉汤作为增菌液，同时推荐了其他增菌液，分别是液体大豆酪蛋白消化物培养基、改良letheen肉汤、GPLP80肉汤、D/E中和肉汤、SCDLP80肉汤；方法三和方法四中其他增菌液的名称、成分和制法均在其标准附录A中明确，增菌液的用量均根据取样量与增菌液体积按1:9的比例添加。
同样是培养白色念珠菌，四种标准的检测方法所用的增菌液各不相同，其详细配方详见表3。从表3可知，化妆品检验体系的增菌液成分要比药品检验体系的增菌液沙氏葡萄糖液体培养基和食品检验体系的增菌液液体沙氏培养基复杂得多。这是因为化妆品是由多种成分组成的日用化学工业产品，样品中含有一种或多种防腐剂，为消除其防腐剂对微生物检验的影响，故化妆品检验体系的增菌液增加了不同的中和剂，可根据样品中所含的防腐剂选择含对应中和剂的增菌液。方法四的附录B中还列举了不同的防腐剂、中和剂以及合适的中和剂和冲洗液的示例 [
从表2可知，方法一、方法二和方法四的培养温度范围都是在30~35℃，而方法三的培养温度范围是在29~31℃。在培养时间上，方法三和方法四均要求不少于20 h，但不超过72 h；方法二规定培养48 h ± 2 h，必要时延长至72 h；方法一的培养时间则规定3~5 d。对比四种方法，方法一的增菌液配方相对简单，培养时间较长；方法二的增菌液配方也相对简单，但取样量较大，培养时间较方法一缩短；而方法三和方法四由于增菌液添加了中和剂，缩短了培养时间。
| 沙氏葡萄糖液体培养基 | 液体沙氏培养基 | SCDLP液体 培养基 | Eugon LT100 肉汤 | 液体大豆酪蛋白消化物培养基 | 改良letheen 肉汤 | GPLP80 肉汤 | D/E中和 肉汤 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 动物组织胃蛋白酶水解物和胰酪胨等量混合物10.0 g | 蛋白胨 10 g | 酪蛋白胨 17.0 g | 酪蛋白酶消化物15.0 g | 酪蛋白酶消化物17.0 g | 酪蛋白酶消化物5.0 g | 蛋白胨 5.0 g | 酪蛋白酶消化物5.0 g |
| 葡萄糖 20.0 g | 葡萄糖 40 g | 葡萄糖 2.5 g | 葡萄糖 5.5 g | 葡萄糖 2.5 g | / | 葡萄糖 20.0 g | 葡萄糖 10.0 g |
| 水1000 mL | 蒸馏水1000 mL | 水1000 mL | 水1000 mL | 水1000 mL | 水1000 mL | 水1000 mL | 水1000 mL |
| / | / | 大豆蛋白胨 3.0 g | 大豆粉木瓜酶消化物5.0 g | 大豆粉木瓜酶消化物3.0 g | 肉类胃酶消化物20.0 g | / | / |
| / | / | 氯化钠5.0 g | 氯化钠4.0 g | 氯化钠5.0 g | 氯化钠5.0 g | / | / |
| / | / | 卵磷脂1.0 g | 卵磷脂1.0 g | / | 卵磷脂0.7 g | 卵磷脂1.0 g | 大豆卵磷脂7.0 g |
| / | / | 吐温80 7.0 g | 吐温80 5.0 g | / | 吐温80 5.0 g | 吐温80 7.0 g | 吐温80 5.0 g |
| / | / | 磷酸氢二钾2.5 g | / | 磷酸氢二钾 2.5 g | / | 磷酸二氢钾1.0 g | / |
| / | / | / | 亚硫酸钠0.2 g | / | 亚硫酸氢钠 0.1 g | / | 亚硫酸氢钠2.5 g |
| / | / | / | 辛苯聚醇9 1.0 g | / | 牛肉浸膏5.0 g | 硫酸镁0.5 g | 五水硫代硫酸钠6.0 g |
| / | / | / | L-胱氨酸0.7 g | / | 酵母浸膏2.0 g | 酵母浸膏2.0 g | 酵母提取物2.5 g |
| / | / | / | / | / | / | / | 巯基乙醇酸钠1.0 g |
| / | / | / | / | / | / | / | 溴甲酚紫0.02 g |
表3. 各标准方法中增菌液配方比较
方法一规定使用沙氏葡萄糖琼脂培养基作为分离培养基；方法二规定同时使用TTC沙氏琼脂培养基和念珠菌显色培养基作为分离培养基；方法三规定沙氏葡萄糖氯霉素琼脂培养基或念珠菌显色培养基作为分离培养基，同时推荐了含抗生素的马铃薯葡萄糖琼脂培养基；方法四规定沙氏葡萄糖氯霉素琼脂培养基作为分离培养基，同时推荐了含抗生素的马铃薯葡萄糖琼脂培养基；除念珠菌显色培养基外，这几种分离培养基的详细配方详见表4。从表4可知，TTC沙氏琼脂培养基添加了氯化三苯四氮唑(TTC)、沙氏葡萄糖氯霉素琼脂培养基和含抗生素的马铃薯葡萄糖琼脂培养基添加了氯霉素，都是为了区别样品中的颗粒与细菌，消除对目标菌白色念珠菌的干扰。
| 沙氏葡萄糖琼脂培养基 | TTC沙氏琼脂 培养基 | 沙氏葡萄糖氯霉素琼脂培养基 | 含抗生素的马铃薯 葡萄糖琼脂培养基 |
|---|---|---|---|
| 动物组织胃蛋白酶水解物 和胰酪胨等量混合物10.0 g | 蛋白胨10 g | 动物组织胃酶消化物5.0 g 酪蛋白胰酶消化物5.0 g | 马铃薯浸膏4.0 g |
| 葡萄糖40.0 g | 葡萄糖40 g | 葡萄糖40.0 g | 葡萄糖20.0 g |
| 琼脂15.0 g | 琼脂20 g | 琼脂15.0 g | 琼脂15.0 g |
| 水1000 mL | 蒸馏水1000 mL | 水1000 mL | 水1000 mL |
| 0.5% TTC溶液 | 氯霉素0.050 g | 氯霉素0.05 g |
表4. 各标准方法中分离培养基配方比较
| 项目 | ChP2010四部通则1106(方法一) | SN/T 3970-2014 (方法二) | SN/T 2206.8-2013 (方法三) | ISO 18416-2015(E) (方法四) |
|---|---|---|---|---|
| 革兰氏染色 | 革兰氏阳性，细胞圆形或卵圆形，有时有芽生细胞 | 革兰氏阳性，细胞圆形或卵圆形，有时有芽生细胞 | 紫色，短椭圆形或细长菌体，有时可见芽生孢子 | 紫色，短卵形或细长细胞，有时有芽生细胞 |
| 芽管形成 试验 | 接种于一滴血清，35~37℃，1~3 h，显微镜观察 | 接种于0.5 mL~1.0 mL牛或马血清中， 37℃ ± 1℃，1.5 h~3.0 h，显微镜观察 | 接种于0.5 mL~1.0 mL胎牛血清或马血清中，36℃ ± 1℃水浴1.5 h~2 h或36℃ ± 1℃培养箱中培养3 h，显微镜观察 | 接种于0.5 mL~1.0 mL胎牛血清或马血清中，37℃ + 1℃水浴1.5 h~2 h或37℃ + 1℃培养箱中培养3 h，显微镜观察 |
| 厚膜孢子 试验 | 接种于1%吐温80玉米培养基表面，30~35℃，24~48 h，显微镜观察 | 接种于1%吐温80玉米培养基表面，25℃，24 h~48 h，显微镜观察 | 接种于1%吐温80玉米培养基表面，30℃ ± 1℃培养 3 d，24 h后显微镜观察 | 接种于1%吐温80玉米培养基表面，32.5℃ ± 2.5℃培养3 d，24 h后显微镜观察 |
表5. 各标准方法中鉴定试验的比较
方法一中描述“疑似菌在念珠菌显色培养基平板上生长的菌落呈阳性反应，应进一步进行适宜的鉴定试验，确证是否为白色念珠菌”，“疑似菌在念珠菌显色培养基平板上生长的菌落呈阴性反应，判供试品未检出白色念珠菌 [
历版中国药典在控制菌检测中均给出了详细的试验方法和判断标准，强调实验者应严格按照标准检验。《中国药典》2015年版未再规定具体的疑似菌株鉴定程序。这是检验理念的变化。在新的理念指导下，实验室首先按药典规定的培养进行控制菌的初步筛查，出现疑似菌株时再结合实验室的具体状况选择适宜的方法(革兰染色镜检、生化实验、基因测序、核糖体分型等)对疑似菌确认，出现争议时以现行版《伯杰氏系统细菌学手册》为准 [
方法一是现行版《中国药典》标准方法，疑似菌的确证试验不规定方法，但《中国药典》2010年版白色念珠菌检查法中疑似菌的确证试验与其余三种标准方法均规定使用传统的检测方法，主要包括革兰氏染色、芽管形成试验和厚膜孢子试验等步骤，它是目前检测念珠菌的金标准。这几种标准方法的芽管形成试验和厚膜孢子试验所用的培养基一致，但在培养温度和培养时间上有细微的差别，详见表5。方法二的附录B还给出了白色念珠菌生长特征图作参考，包括了厚膜孢子图、革兰氏染色图和芽管图。
方法一规定进行方法适用性试验，使用CMCC(F)98001作为阳性对照菌株；方法二未规定进行方法适用性试验和标准菌株；方法三未规定进行方法适用性试验，但在芽管形成试验规定使用白色念珠菌ATCC10231作为阳性对照菌株和热带念珠菌ATCC750作为阴性对照菌株；方法四规定使用白色念珠菌ATCC10231进行方法适用性试验。
四种方法的结果报告均根据鉴定结果报告是否检出目标菌，结果报告单位与取样量对应一致。
通过对药品、食品与化妆品白色念珠菌检查方法相关内容的分析与对比发现：药品微生物检查法更具科学性、开放性和灵活性，有利于鼓励方法创新和现代仪器设备的使用，促进检测技术的发展，具有指导意义；食品微生物与化妆品检查法则给出更详细的检验程序，有利于实验操作的标准化，具有实操意义。本文围绕三套检验体系四种检验方法的差异，探讨不同产品中白色念珠菌检查法的检验特点，建议相互取长补短，从实验具体操作和实验思路拓展等方面提出可相互参考借鉴的内容，解决实验操作中的细节问题，指导检验实验科学规范地发展与完善，为《化妆品安全技术规范》中白色念珠菌检查法的修订提供参考，提高我国化妆品微生物控制水平，保障广大人民群众的用妆安全。
广东省医学科学技术研究基金项目(20211128331164)。
钟燕飞,凌晓敏,朱欢敏,林铁豪. 不同检验体系中白色念珠菌检查法的比较研究Comparative Study of Candida albicans Test Methods in Different Test Systems[J]. 药物资讯, 2024, 13(03): 253-260. https://doi.org/10.12677/pi.2024.133030