仪器：荧光分光光度仪(Agilent Cary eclipse，Germany)，pH计(PHS-25，上海)。

试剂：牛血清白蛋白(BSA，Sigma公司)，头孢曲松钠(CRO，Sigma公司，纯度 ≥ 98%)，其余试剂均为分析纯；实验用水为二次蒸馏水。

头孢曲松钠储备液的配制：准确称量10.2 mg，定容为100 mL，浓度为0.102 g/L；牛血清白蛋白储备液的配制：用pH = 7.38的Tris-HCl缓冲溶液定容，使其浓度为0.682 mg/mL，置于冰箱冷藏保存。

在25 mL比色管中依次加入2.00 mL BSA、5.00 mL 0.5mol/LNaCl溶液，依次加入0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40、1.60、1.80、2.00 mL的头孢曲松钠溶液，用pH = 7.38的Tris-HCl缓冲溶液定容。荧光比色皿为1 cm，入射和出射狭缝均为5 nm，在310 K，298 K，290 K下扫描体系的荧光光谱和同步荧光光谱。

蛋白质呈现出荧光效应是因色氨酸(Trp)，酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)残基发色团共同作用 [ 3 ] 。Phe激发的荧光强度与前两者相比很小，因此，λ_ex= 280 nm时可激发Trp和Tyr的荧光，λ_ex= 295 nm只有Trp荧光被激发。

设置λ_ex= 280 nm和λ_ex= 295 nm时，对CRO-BSA体系进行荧光光谱测定，见图1。

图1. CRO-BSA体系的荧光光谱(T = 310 K，a: λ_ex= 280 nm；b: λ_ex= 295 nm，c_BSA= 8.21 × 10⁻⁷mol/L；0~10 c_CRO= (0, 0.20, 0.40, 0.60, 0.80, 1.00, 1.20, 1.40, 1.60, 1.80, 2.00) × 6.16 × 10⁻⁶mol/L)

图2. 不同温度下CRO-BSA体系的Stern-Volmer曲线(a: λ_ex= 280 nm；b: λ_ex= 295 nm)

从图1可以看出，CRO的浓度从0~10浓度逐渐增大，BSA的荧光强度不断减低，表明CRO的加入，使BSA荧光猝灭，和BSA发生相互作用。

为进一步研究体系的相互作用机制，根据Stern-Volmer方程 [ 6 ] ：

F 0 F = 1 + K s v c q = 1 + K q τ c q (1)

式中F、F₀分别为有、无猝灭剂时的荧光强度；K_sv为动态猝灭常数(即Stern-Volmer猝灭常数)；c_q为猝灭剂的浓度；K_q为荧光猝灭速率常数，各类猝灭剂对生物大分子K_q一般为2.0 × 10¹⁰L∙mol⁻¹∙s⁻¹；τ₀：生物分子荧光平均寿命，一般为10⁻⁸s [ 7 ] 。

以F₀/F对c_q作图，得到不同温度下的K_sv和K_q，见图2。

根据不同温度下CRO-BSA体系Stern-Volmer方程，得到λ_ex= 280 nm，λ_ex= 295 nm时K_q和K_sv，见表1。

表1. CRO-BSA体系的荧光猝灭反应参数

n是CRO-BSA的结合位点数；r₁是方程F₀/F~c_q的线性相关系数；r₂是方程log(F₀-F)/F~lgc_q的线性相关系数。

表1数据表明，不同温度下，λ_ex= 280 nm和λ_ex= 295 nm的K_q> 2.0 × 10¹⁰L·mol⁻¹·s⁻¹，表明CRO的加入使BSA发生了静态猝灭，同时，随着温度升高，K_sv略有减小，不同激发波长下的变化趋势一致，表明CRO-BSA形成基态复合物，发生静态猝灭 [ 8 ] ，两者结论一致。

根据CRO-BSA的荧光猝灭反应过程为静态猝灭，同时运用下述公式(2)计算求出结合位点数n以及结合常数K_a。

lg ( F 0 − F ) / F = lg K a + n lg c q (2)

不同温度下，λ_ex= 280 nm和λ_ex= 295 nm时，以log(F₀− F)/F~lgc_q作图，得到图3。

图3. 不同温度下CRO-BSA体系log(F₀− F)/F~lgc_q曲线(a: λ_ex= 280 nm b: λ_ex= 295 nm)

从图3拟合曲线方程得到结合位点数n ≈ 1，说明CRO与BSA只有一个结合位点；表1中的数据表明，相同温度下λ_ex= 280 nm和λ_ex= 295 nm的K_a不同，且有一定的差异，λ_ex= 295 nm的K_a大于λ_ex= 280 nm的K_a，但是K_a随温度的变化趋势一致，随着温度增加，K_a略有降低，表示CRO-BSA配合物稳定性略有下降，同时诠释了体系的荧光猝灭为静态猝灭 [ 9 ] 。

图4为不同温度下，λ_ex= 280 nm和λ_ex= 295 nm时，随着CRO浓度逐渐增大，BSA的荧光猝灭曲线。

图4. λ_ex为280 nm、295 nm时CRO-BSA体系的荧光猝灭曲线(a = 298 K；b = 310 K)

从图4中可以看出，在不同温度下，当λ_ex= 280 nm或λ_ex= 295 nm时，体系的荧光猝灭曲线并未重合，说明在CRO-BSA的反应中，Tyr和Trp都有参与，因小分子在BSA中主要结合位置是IIA和IIIA的疏水腔中 [ 10 ] ，对于CRO-BSA体系而言，CRO主要在BSA的亚结构IIA位置结合。

图5. CRO-BSA体系的同步荧光光谱(T = 310 K，a: Δλ = 15 nm；b: Δλ = 60 nm，C_BSA= 8.21 × 10⁻⁷mol/L；0~10 c_CRO= (0, 0.20, 0.40, 0.60, 0.80, 1.00, 1.20, 1.40, 1.60, 1.80, 2.00) × 6.16 × 10⁻⁶mol/L)

Δλ = 15 nm和Δλ = 60 nm分别表示BSA中Tyr残基和Trp残基的光谱特征 [ 11 ] ，若同步荧光的λ_max发生位移，表明基团分子极性发生变化 [ 12 ] 。图5为310 K时Δλ = 15 nm和Δλ = 60 nm时CRO-BSA体系的同步荧光光谱。

从图5看出，CRO-BSA体系的同步荧光光谱随着CRO浓度逐渐增大，BSA中的Tyr和Trp残基均出现明显的同步荧光猝灭，表明BSA中的Tyr和Trp残基参与了CRO与BSA的结合作用，但是最大吸收波长几乎没有发生位移，说明Tyr和Trp残基周围的微环境没有发生改变。

根据公式(1)和(2)，计算得到CRO-BSA体系的同步荧光猝灭反应参数，见表2。

表2. CRO-BSA体系的同步荧光猝灭反应参数

表2中数据表明，不同温度下，Δλ = 15 nm和Δλ = 60 nm的K_q> 2.0 × 10¹⁰L∙mol⁻¹∙s⁻¹，表明CRO与BSA相互作用发生了静态猝灭；同时，温度升高，K_sv略有减小，这一结论与CRO-BSA体系荧光猝灭反应参数呈现的结论一致，表明CRO-BSA形成基态复合物，发生静态猝灭，同时结合位点数≈1，荧光和同步荧光结论一致。

荧光猝灭比率R_SFQ[ 13 ] (R_SFQ= (F₀-F)/F₀)和荧光猝灭比例分数N_SFQ[ 14 ] (N_{SFQ (Tyr)}= R_{SFQ (Tyr)}/(R_{SFQ (Tyr)}+ R_{SFQ (Trp)}，N_{SFQ (Trp)}= 1 − N_{SFQ (Tyr)})可进一步表示BSA中Tyr和Trp残基参与体系结合情况。当T = 310 K，C_BSA= 8.21 × 10⁻⁷mol/L，C_CRO= (0.20, 0.40, 0.60, 0.80, 1.00, 1.20, 1.40, 1.60, 1.80, 2.00) × 6.16 × 10⁻⁶mol/L时，N_{SFQ (Tyr)}分别为61.79%、59.33%、58.17%、55.82%、56.21%、55.61%、55.28%、54.95%、54.11%、54.28%，平均值为56.55%；N_{SFQ (Trp)}分别为38.21%、40.67%、41.83%、44.18%、43.79%、44.39%、44.72%、45.05%、45.89%、45.72%，平均值为43.45%，结果表明BSA中Tyr和Trp残基均参与体系结合反应，与上述CRO-BSA结合位置的结论一致，且N_{SFQ (Tyr)}> N_{SFQ (Trp)}，说明体系结合反应更靠近Tyr残基，与表2中结合常数K_a数据结论一致。

当T变化不大时，根据Vant’s Hoff方程(公式3)和热力学方程(公式4)，可计算CRO-BSA体系的热力学参数，结果见表3。

R ln K = Δ S − Δ H / T (3)

Δ G = Δ H − T Δ S (4)

温度变化不大时，ΔH基本不变化，以RlnK与1/T作图，ΔH即可由不同温度下CRO-BSA体系的Vant's-Hoff线性关系图得到，见图6。从图中可以看出λ_ex= 280 nm，λ_ex= 295 nm，Δλ = 15 nm及Δλ = 60 nm时，RlnK与1/T呈现良好的线性关系，r分别为0.9837，0.9998，0.9909和0.9994。

表3. 不同温度下CRO-BSA体系的热力学参数

图6. 不同温度下CRO-BSA体系的Vant’s-Hoff曲线(a: λ_ex= 280 nm；b: λ_ex= 295 nm；c: Δλ = 15 nm；d: Δλ = 60 nm)

从表3可以看出，λ_ex= 280 nm，λ_ex= 295 nm，Δλ = 15 nm及Δλ = 60 nm时，计算所得热力学参数略有差异，相同温度下，λ_ex= 280 nm的ΔG小于λ_ex= 295 nm，Δλ = 15 nm的ΔG小于Δλ = 60 nm，进一步表明CRO与BSA中Tyr残基结合趋势更强，且反应自发进行；ΔH > 0表明CRO与BSA结合为吸热过程；ΔS > 0表明体系环境中水分子以有序的方式围绕体系，因ΔG < 0，ΔH > 0，ΔS > 0，由此可判断CRO与BSA结合的作用力是以疏水作用为主，静电引力为辅 [ 15 ] 。

药物协同性可以用Hill方程的系数n_H进行定量分析，Hill方程 [ 16 ] (5)：

lg ( Y 1 − Y ) = lg K a + n H lg [ L ] (5)

Y为结合饱和分数；n_H为Hill系数；同时根据实验中公式(6)，(7)

Y / ( 1 − Y ) = Q / ( Q m − Q ) (6)

Q = 1 − F / F 0 (7)

1/Q对1/[L]作图得到1/Q_m，n_H由lg[Y/(1-Y)]对lg[L]作图得到，结果见表4。

表4. 不同温度下CRO-BSA的Hill系数

从表4中数据表明，在不同温度下，λ_ex= 280 nm，λ_ex= 295 nm，Δλ = 15 nm及Δλ = 60 nm时的n_H≈ 1，因n_H> 1表现为正协同作用，n_H< 1为负协同作用，n_H= 1没有协同作用 [ 17 ] ，所以，在CRO与BSA结合过程中没有协同作用，不影响后继配体与BSA的结合。

CRO-BSA的结合率可以根据同步荧光所得K_a值，结合位数n = 1，根据公式(8)、(9)分别计算CRO与BSA中Tyr和Trp残基的药物结合率和CRO蛋白结合率 [ 18 ] 。

药物结合率： W ( Q ) = K a ( Q + B ) + 1 − K a 2 ( Q − B ) 2 + 2 K a ( Q + B ) + 1 2 K a Q × 100 % (8)

蛋白结合率： W ( B ) = K a ( Q + B ) + 1 − K a 2 ( Q − B ) 2 + 2 K a ( Q + B ) + 1 2 K a B × 100 % (9)

式中Q和B分别代表CRO和BSA的总浓度。

CRO为常见的临床注射用头孢类抗生素，本实验以头孢曲松钠注射用无菌粉末为例，模拟人体体温310 K时，当4 mg/L < c_CRO< 8 mg/L时，计算得到CRO-BSA中Tyr残基的药物结合率W(Q)为6.5%~12.6%，药物游离率为93.5%~87.4%，Trp残基的药物结合率W(Q)为6.35%~12.07%，药物游离率为93.65%~87.93%，由此可见，Tyr和Trp残基的药物结合率W(Q)与游离的药物浓度变化不大，说明体系中Tyr和Trp残基的结合对CRO的药效基本没有影响。

随着CRO浓度增大，4.08 mg/L < c_CRO< 8.16 mg/L时，CRO在Tyr残基的蛋白结合率W(B)为94.6%~97.4%，蛋白游离率为5.4%~2.6%，在Trp残基的蛋白结合率W(B)为90.71%~95.41%，蛋白游离率为9.29%~4.59%。结果表明：CRO与BSA结合后，游离的Tyr和Trp残基蛋白数量明显减少，CRO蛋白结合率可达95%以上，这与静脉滴注CRO (c_CRO< 25 mg/L)的蛋白结合率95% [ 19 ] 基本一致，数据表明，当CRO进入人体后，立即与血液中蛋白结合，会使血浆蛋白中游离的Tyr残基和Trp残基数量大大减少，CRO在血液中可以被充分的转运，能持续释放，药物浓度较稳定，因此CRO在人体内不会被代谢，主要以原形自消化系统和泌尿系统排出。