将新鲜秋葵的种子洗净、磨碎并在烘箱60℃干燥24 h，备用。

根据Wang等 ‎[ 9 ] 的方法并稍作修改用提取秋葵种子中的游离酚。取一定量的秋葵种子粉末，以不同料液比加入不用浓度的乙醇溶液，在不同温度和时间下进行超声提取，得到的混合物离心10 min以去除沉淀。随后将提取液采用D101大孔树脂纯化，先用纯水洗脱，以达到去除糖、蛋白质等杂质的目的。最后用乙醇洗脱浓缩，得到秋葵种子游离酚(OSFP)。

TPC采用福林法 ‎[ 8 ] 测定，以没食子酸为校准曲线的参考化合物，TPC表示为每克秋葵种子干重的没食子酸当量(mg GAE/g dw)。

1) 料液比对种子游离酚TPC提取的影响

称取1 g秋葵种子粉末，在60℃，超声功率144 W下，加入不同料液比(1:60、1:70、1:80、1:90)的70%乙醇，超声提取50 min。考察不同料液比对秋葵种子TPC提取的影响。

2) 乙醇浓度对种子游离酚TPC提取的影响

称取1 g秋葵种子粉末，在60℃，超声功率144 W下，以料液比1:70分别加入70 mL不同浓度的乙醇(50%、60%、70%、80%)，144 W超声时间为50 min。考察不同乙醇浓度对秋葵种子游离酚TPC提取的影响。

3) 时间对种子游离酚TPC提取的影响

称取1 g秋葵种子粉末，在60℃下，超声功率144 W下，以料液比1:70加入70 mL 70%乙醇，随后考察不同超声时间(30 min、40 min、50 min、60 min)对秋葵种子TPC提取量的影响。

4) 温度对种子游离酚TPC含量的影响

称取1 g秋葵种子粉末，以料液比1:70加入70 mL 70%乙醇，在超声功率144W提取50 min，考察不同温度(30℃、40℃、50℃、60℃)对秋葵种子TPC提取量的影响。

表1. 秋葵种子游离酚正交实验因素水平表

在单因素实验的基础上，以秋葵种子游离酚提取量为响应值(Y)，选取料液比(A)、乙醇浓度(B)、时间(C)、温度(D)4个因素，每个因素设定3个水平。利用正交法优化确定秋葵种子游离酚的最佳提取条件，正交实验因素水平见表1。

1) DPPH 自由基清除率测定

参照Peanparkdee等 ‎[ 10 ] 的方法测定OSFP的DPPH自由基清除率。配置0.2 mmol/L的DPPH无水乙醇溶液，摇匀后避光备用。向0.2 mL OSFP待测液中加入2 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液，充分混合后避光静置30 min，用紫外分光光度计在517 nm处测定吸光度。以去离子水为空白对照，以维生物素C为阳性对照。DPPH自由基清除率按照公式(1)计算：

DPPH 清 除 率 / % = [ 1 − ( A i − A i 0 ) A 0 ] × 100 % (1)

式中：A₀：2 mL DPPH溶液加2 mL无水乙醇的吸光度；A_i：2 mL OSFP待测液加2 mL DPPH的吸光度；A_i0：2 mL OSFP待测液加2 mL无水乙醇的吸光度。

2) 亚铁离子还原能力测定

根据Zhang等 ‎[ 11 ] 的方法并稍作修改测定亚铁离子的还原能力。将醋酸缓冲液(30 mmol/L, pH 3.6)、TPTZ (10 mmol/L)和FeCl₃(20 mmol/L)，以10:1:1的比例混合配置FRAP工作液。HCl (40 mmol/L)、TPTZ (10 mmol/L)和FeCl₃(20 mmol/L)同样以10:1:1的比例混合，配置FRAP空白液。两种溶液都放于37℃的水浴中备用。以Vc作为阳性对照，将0.1 mL OSFP样品和1.9mL FRAP试剂摇匀混合并避光反应30 min，然后用紫外可见分光光度计在593 nm处测定吸光度。以硫酸亚铁为参比化合物，采用标准曲线计算FRAP值。亚铁离子还原能力按照公式(2)计算，再将结果换算成μmol/L Fe²⁺表示。

FRAP 还 原 率 ( % ) = [ ( A i − A i 0 ) − A 0 A 0 ] × 100 % (2)

式中：A_i= 0.1 mL OSFP待测液 + 1.9 mL FRAP工作液；A_i0= 0.1 mL OSFP待测液 + 1.9 mL FRAP空白液；A₀= 0.1 mL蒸馏水 + 1.9 mL FRAP工作液。

3) ABTS =自由基清除率测定

ABTS自由基清除活性是根据Vinci等 ‎[ 12 ] 的方法进行测定的，稍作修改。将ABTS (7 mmol/L)和K₂S₂O₈(2.4 mmol/L)等体积混合后静置在黑暗中12~14 h。然后将混合液用40 mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH = 7.4)稀释至吸光度为0.700 ± 0.019，制备标准ABTS溶液。取0.3 mL的OSFP待测液，加入2.7 mL的标准ABTS溶液混合，震荡均匀。在黑暗中孵育30 min后，用紫外可见分光光度计在735 nm处测定吸光度，以VC作为阳性对照。ABTS清除能力按照公式(3)计算：

(3)

式中：A₀：2.7 mL ABTS标准溶液加0.3 mL蒸馏水的吸光度；A_i：2.7 mL ABTS标准溶液加0.3 mL OSFP待测液的吸光度。

图1. 料液比对种子游离酚提取含量的影响

如图1所示，随着料液比的增加，总酚含量(TPC)呈现先上升后下降的趋势，当料液比为1:70时，秋葵种子游离酚的提取量最大，此时为32.09 GAE mg/g DW。这可能是由于种子游离酚与溶剂之间的浓度差随着料液比的增加而增大，从而加速了游离酚向细胞外扩散的速度。当料液比为1:70时，种子游离酚的扩散和溶解达到平衡状态。在此基础上进一步增加料液比反而会导致游离酚提取量的下降，这可能与色素和醇溶性的杂质在过大的料液比下加速溶出，从而影响游离酚的提取过程 ‎[ 13 ] 。

图2. 乙醇浓度对种子游离酚提取含量的影响

乙醇是一种经济实惠且无毒的溶剂，具有优异的选择性和高极性，使其在溶解酚类化合物方面非常有效 ‎[ 14 ] 。如图2所示，秋葵种子游离酚的TPC随着乙醇浓度的升高呈先增加后降低的趋势，到浓度为70%时提取效果最佳，TPC达32.61 GAE mg/g DW。而当乙醇浓度超过70%之后，提取量逐渐下降。这可能是由于乙醇浓度过高，导致其他亲脂物质的提取增加，同时降低了游离酚类化合物的溶解度，这与赵强 ‎[ 15 ] 等从藜麦糠中超声提取游离酚的现象相似。

图3. 温度对种子游离酚提取含量的影响

由图3可知，秋葵种子游离酚的TPC提取受温度的影响显著，40℃时达到最大值(34.90 GAE mg/g DW)，50℃后TPC显著降低。温度的升高除了增加生物活性化合物在溶剂中的溶解度和扩散速率外，还会破坏酚类物质与细胞成分(如多糖和蛋白质)的相互作用，进一步增加酚类物质的释放 ‎[ 16 ] 。然而，高温使得酒精挥发量增多，也会导致生物活性化合物的热降解和分解，从而对提取效率产生不利影响 ‎[ 17 ] 。

图4. 时间对种子游离酚提取含量的影响

如图4所示，当时间到达50 min时，秋葵种子的TPC提出率最大。然而，当时间超过50 min后，TPC出现下降趋势。这是可能由于延长提取时间增加了酚类化合物的分解以及蒸发时溶剂的损失，进一步减少了传质 ‎[ 18 ] 。此外，持续加热可能导致其他非酚类化合物生成，这些化合物可能与酚类化合物发生反应，进一步降低其稳定性和提取效率。

图5. 秋葵种子游离酚的 DPPH 自由基清除能力

DPPH自由基清除的机制是将样品中的羟基上的原子或电子转移给DPPH自由基，从而生成稳定的DPPH分子。如图5所示，秋葵种子游离酚表现出对DPPH自由基的清除能力，最高达到80%，优于华艳宏等 ‎[ 9 ] 提取的藜麦种子游离酚，展现出较好的DPPH清除能力。

图6. 秋葵种子游离酚亚铁离子还原能力

FRAP是一种用于评估抗氧化能力的方法，它通过在酸性条件下将Fe³⁺-TPTZ还原为Fe²⁺-TPTZ过程中某个指标值来测定抗氧化剂的活性 ‎[ 20 ] 。图6显示，OSFP的FRAP值呈剂量依赖性增加，其还原亚铁离子的能力与Vc相当。这一结果显著高于Xia等人 ‎[ 8 ] 所报道的从秋葵荚中提取的游离酚的FRAP值。我们推测这可能是由于二者在化学结构上存在差异，导致其抗氧化活性不同，同时也证明了OSFP有较强的亚铁离子还原能力。

图7. 秋葵种子游离酚的ABTS自由基清除能力

ABTS是一种过氧化氢酶底物，在硫酸钾的作用下形成稳定的自由基ABTS。抗氧化反应会导致溶液颜色变浅，而在波长734 nm处的吸光度的变化可用来反映其抗氧化活性 ‎[ 21 ] 。由图7可知，当浓度达到10 μg/mL时，OSFP对ABTS的清除率达到为100%，与Vc相当。OSFP的IC₅₀为3.54 μg/mL，表明OSFP具有良好的清除ABTS的能力。