目的:通过克隆Serratia sp.M01中的硫氧还蛋白编码基因trxA、trxC,构建原核表达载体并转化至E. coli BL21(DE3)中,探究工程菌的抗铬(VI)能力。方法:以Serratia sp. CM01的DNA作模板,采用PCR扩增trxA、trxC基因,构建表达载体pET-28a(+)-trxA、pET-28a(+)-trxC并转化至E. coli BL21(DE3)表达以构建工程菌。以测定工程菌的Cr(VI)耐受、生长曲线,确定工程菌的抗Cr(VI)能力。结果:利用基因克隆技术,成功构建出trxA、trxC工程菌。测定两种工程菌的生长情况,发现在无Cr(VI)条件下,三种工程菌生长曲线没有差异(P > 0.05)。在Cr(VI)的胁迫下,两种工程菌在稳定期的菌量为:Serratia sp. CM01 > trxA ≈ trxC > Control (P < 0.05);两种工程菌的Cr(VI)耐受能力为Serratia sp. CM01 > trxA > trxC > Control (P < 0.05)。结论:trxA、trxC基因编码的蛋白均具备的耐受Cr(VI)能力,工程菌trxA抗Cr(VI)能力强于trxC,工程菌具有治理实际环境中Cr(VI)污染的潜力。 Objective: The engineered bacteria’s chromium (VI) resistance was investigated by cloning the thi-oredoxin-encoding genestrxAandtrxCfrom Serratia sp. CM01, constructing a prokaryotic expres-sion vector and transforming it into E. coli BL21(DE3). Methods: The DNA of Serratia sp. CM01 was used as a template to amplify the trxA and trxC genes by PCR, and the expression vectors pET-28a(+)-trxA and pET-28a(+)-trxC were constructed and transformed into E. coli BL21(DE3) for expression to construct the engineering bacteria. The Cr(VI) resistance of the engineered bacteria was determined by measuring the Cr(VI) tolerance and growth curves of the engineered bacteria. Results: By using gene cloning technology, trxA and trxC engineering bacteria were successfully constructed. The growth of the two engineered bacteria showed no difference under Cr(VI)-free cir-cumstances (P > 0.05). In Cr(VI) presence, the viable bacterial cell mount during the stabilization phase was Serratia sp. CM01 > trxA ≈ trxC > Control (P < 0.05), and the tolerance rate of Cr(VI) was ranked Serratia sp. CM01 > trxA > trxC > Control (P < 0.05). Conclusion: Cr(VI)-tolerance of the pro-teins corresponding to the trxA and trxC genes. trxA has a stronger anti-Cr(VI) ability than trxC. It can potentially handle Cr(VI) pollution in the virtual environment.
目的:通过克隆Serratia sp. M01中的硫氧还蛋白编码基因trxA、trxC,构建原核表达载体并转化至E. coli BL21(DE3)中,探究工程菌的抗铬(VI)能力。方法:以Serratia sp. CM01的DNA作模板,采用PCR扩增trxA、trxC基因,构建表达载体pET-28a(+)-trxA、pET-28a(+)-trxC并转化至E. coli BL21(DE3)表达以构建工程菌。以测定工程菌的Cr(VI)耐受、生长曲线,确定工程菌的抗Cr(VI)能力。结果:利用基因克隆技术,成功构建出trxA、trxC工程菌。测定两种工程菌的生长情况,发现在无Cr(VI)条件下,三种工程菌生长曲线没有差异(P > 0.05)。在Cr(VI)的胁迫下,两种工程菌在稳定期的菌量为:Serratia sp. CM01 > trxA ≈ trxC > Control (P < 0.05);两种工程菌的Cr(VI)耐受能力为Serratia sp. CM01 > trxA > trxC > Control (P < 0.05)。结论:trxA、trxC基因编码的蛋白均具备的耐受Cr(VI)能力,工程菌trxA抗Cr(VI)能力强于trxC,工程菌具有治理实际环境中Cr(VI)污染的潜力。
硫氧还蛋白,基因克隆
Mengjia Wang, Yanqing Wu, Yu Xiao, Hong Xiao*
School of Public Health, Chongqing Medical University, Chongqing
Received: Nov. 26th, 2023; accepted: Dec. 28th, 2023; published: Feb. 2nd, 2024
Objective: The engineered bacteria’s chromium (VI) resistance was investigated by cloning the thioredoxin-encoding genes trxA and trxC from Serratia sp. CM01, constructing a prokaryotic expression vector and transforming it into E. coli BL21(DE3). Methods: The DNA of Serratia sp. CM01 was used as a template to amplify the trxA and trxC genes by PCR, and the expression vectors pET-28a(+)-trxA and pET-28a(+)-trxC were constructed and transformed into E. coli BL21(DE3) for expression to construct the engineering bacteria. The Cr(VI) resistance of the engineered bacteria was determined by measuring the Cr(VI) tolerance and growth curves of the engineered bacteria. Results: By using gene cloning technology, trxA and trxC engineering bacteria were successfully constructed. The growth of the two engineered bacteria showed no difference under Cr(VI)-free circumstances (P > 0.05). In Cr(VI) presence, the viable bacterial cell mount during the stabilization phase was Serratia sp. CM01 > trxA ≈ trxC > Control (P < 0.05), and the tolerance rate of Cr(VI) was ranked Serratia sp. CM01 > trxA > trxC > Control (P < 0.05). Conclusion: Cr(VI)-tolerance of the proteins corresponding to the trxA and trxC genes. trxA has a stronger anti-Cr(VI) ability than trxC. It can potentially handle Cr(VI) pollution in the virtual environment.
Keywords:Thioredoxin, Gene Cloning
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近年来,研究者们通过分离鉴定发现了多种有抗Cr(VI)能力的细菌,如Serratia sp. S2 [
在前期研究中,本课题组从重庆市某中小电镀厂聚集地的Cr(VI)污染区域的淤泥中分离筛选得到对外源性高浓度Cr(VI)具有一定抗性的Serratia sp. CM01 [
Serratia sp. CM01来源于本课题组前期在长期被高浓度Cr(VI)污染的环境中分离筛选出的一株能够耐受高浓度Cr(VI)的野生沙雷氏菌 [
将Serratia sp. CM01从−80℃冰箱取出,接入LB培养基中,200 rpm,37℃,复苏12 h。用接种环取菌液在LB固体培养基上进行分区划线,37℃静置过夜培养。次日,挑取单菌落接入新的LB液体培养基中,200 rpm,37℃,过夜培养,得纯化菌液,用于DNA模板提取。
根据NCBI中Serratia sp. CM01的全基因组测序结果(PRJNA675313),已知的trxA、trxC基因序列,利用软件Primer Premier 5.0设计特异性PCR上下游引物,并在两端末端引入下游操作所需的特异性限制性核酸内切酶的酶切位点,碱基序列发送至上海生工合成引物,具体序列见表1。
引物名称 | 碱基序列(5’-3’) | 酶切位点 |
---|---|---|
trxA-F | CCCAAGCTTCTAACGCCTGGATGGG | Hind III |
trxA-R | CCGGAATTCAAAACACGGGCTGAGT | EcoR I |
trxC-F | CCGGAATTCTTGTCGTCGTCACTGC | EcoR I |
trxC-R | CCCAAGCTTAATGGCGGGATACGGC | Hind III |
表1. 引物序列
注:1) 下划波浪线部分为保护碱基。2) 下滑直线部分为酶切位点。
将Serratia sp. CM01在LB培养基中培养至平台期,采用水煮沸模板法获得其基因组DNA [
采用限制性内切酶对纯化的PCR产物和表达载体pET-28a(+)进行双酶切处理,采用通用型DNA纯化回收试剂盒将所得产物纯化。将目标DNA片段连接到pET-28a(+),生成重组质粒pET-28a(+)-trxA、pET-28a(+)-trxC。将重组质粒转移到大肠杆菌BL21 (DE3)中,构建trxA和trxC工程菌。以空载体pET-28a(+)为对照菌株,采用LB固体培养基(含50 ug/ml卡那霉素)和基因扩增技术(PCR)筛选含有目的基因的细菌,通过DNA测序验证工程菌中目的基因的碱基序列。
在含有50 μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中分别接入两种种工程菌,培养至对数期(OD≈0.6),加入诱导剂IPTG,30℃培养6 h,同时诱导含空pET-28a(+)质粒的BL21(DE3)作为阴性对照。采用水煮法提取工程菌中蛋白,采用BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)测定蛋白浓度。对提取的蛋白进行10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western Blotting免疫印记实验,测定蛋白的大小和表达水平 [
在含有50 μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中分别接入两种工程菌,37℃过夜培养。将菌液调制0.5麦氏浊度,按1:100的比例分别接入不含Cr(Ⅵ)和含5 mg/L Cr(Ⅵ)的LB液体培养基中,同时以含有pET-28a(+)空质粒的BL21(DE3)作为对照组,使用BIOSCREEN全自动生长曲线分析仪测定其24 h的生长曲线。
在LB液体培养基中分别接入两种工程菌、野生菌株CM01和对照株BL21 (DE3),37℃过夜培养。将4种菌液稀释至0.5麦氏浊度,按1:100分别接入含Cr2O72−(0, 5, 10, 15, 20 mg/L)的LB液体培养基中,37℃培养24 h,用紫外分光光度计测定OD600。
所有实验组都设置3个平行对照。采用统计软件SPSS19.0进行统计分析,P < 0.05表示差异有统计学意义。
如图1所示,trxA、trxC工程菌中分别扩增出,trxA、trxC基因,其特异性引物对应的电泳条带大小与预期相符合(trxA基因:770 bp;trxC基因:790 bp)。T7/T7 TER通用引物对扩增出来片段由于含有pET-28a(+)的部分基因和T7启动子下游的多克隆位点及His编码序列等基因,因此条带大小理论上应大于特异性引物对扩增出的条带约230 bp,工程菌中trxA和trxC基因的通用引物对条带大小大概在1000 bp处,符合预期结果,说明trxA、trxC工程菌构建成功(图1A和图1B),重组质粒的建立过程如图1(C)所示。
图1. 重组表达质粒pET-28a(+)-trxA、trxC的PCR鉴定
两种工程菌中的蛋白表达情况如图2所示。由于工程菌蛋白进行表达时会融合一段pET-28a序列本身所编码的肽段,因此目的蛋白条带大小比预测值略大(预测值:trxA蛋白11.77 KDa,trxC蛋白14.15 KDa),trxA蛋白实际表达大小约为13 KDa (3泳道),trxC蛋白实际表达约为16 KDa (5泳道)。说明工程菌中trxA、trxC蛋白表达成功。
图2. 两种工程菌中trxA/trxC蛋白的SDS-PAGE电泳图及Western blotting分析
采用全自动生长曲线分析仪测定两种工程菌、Serratia sp. CM01和Control strain (BL21(DE3))的生长曲线(图3),发现Cr(VI)对菌株生长有显著胁迫作用。在没有Cr(VI)胁迫下(图3A),两种菌的生长曲线与对照组BL21 (DE3)的生长曲线没有明显差异(P > 0.05)。在Cr(VI)胁迫的条件下(图3B),工程菌与对照组BL21 (DE3)表现出不同的生长趋势,并且trxA和trxC到达稳定期时间基本相同,稳定期菌量为CM01 > trxA ≈ trxC > BL21 (DE3) (P < 0.05),说明工程菌内存在的trxA、trxC蛋白可帮助其适应Cr(VI)胁迫环境。
根据两种工程菌、Serratia sp. CM01和对照株BL21 (DE3)菌株在不同浓度Cr(VI)的LB培养基中存活24 h后的A600值,可以看出各菌株对Cr(VI)的耐受能力有所不同。结果如图4所示,各菌对Cr(VI)的耐受能力依次为:Serratia sp. CM01 > trxA > trxC > BL21 (DE3) (P < 0.05)。即工程菌ChrA、trxC对Cr(VI)的抗性强于对照菌株BL21 (DE3)。在5 mg/L和10 mg/L Cr(VI)浓度下,对照菌株BL21 (DE3)几乎无法生
图3. 两种工程菌的生长曲线
长,不具备在含Cr(VI)环境中生存的能力,而通过基因重组构建得到的trxA、trxC工程菌生长情况较好,表明trxA、trxC蛋白赋予工程菌一定程度的耐Cr(VI)能力,且trxA蛋白赋予工程菌的抗Cr(VI)能力强于trxC蛋白。
图4. 不同Cr(Ⅵ)浓度下各菌株的铬耐受能力
微生物法具有经济效益高、环保等优点,被认为是修复Cr(VI)环境污染的主流方法之一 [
本研究选取了Serratia sp. CM01中的硫氧还蛋白trxA、trxC为研究对象,利用基因工程技术,构建了两种基因工程菌,并通过相关蛋白的异源表达使菌株具有抗铬能力,但工程菌的铬耐受能力弱于Serratia sp. CM01,表明Serratia sp. CM01的抗Cr(VI)过程不仅依赖于硫氧还蛋白系统,还依赖于全基因组中与铬代谢相关的其他基因共同作用。与野生菌株相比,工程菌的Cr(VI)抗性没有那么强,但解决了野生型菌株不可控性和可能存在的人体危害作用,因此不可否认工程菌具有处理Cr(VI)污染的潜力,可通过进一步研究应用于实际环境中进行铬污染治理。
本项目所使用的大型仪器设备均由重庆医科大学公共卫生学院提供。
本研究由国家自然科学基金(项目编号:cstc2020jcyj-msxmX0540)和重庆医科大学学生科研创新项目(项目编号:SIEP202142)提供资助。
王梦佳,吴焰清,肖 雨,肖 虹. 沙雷氏菌CM01来源硫氧还蛋白的抗铬(VI)能力研究Analysis of the Chromium (VI) Resistance of the Thioredoxin of Serratia sp. CM01[J]. 生物物理学, 2024, 12(01): 1-8. https://doi.org/10.12677/BIPHY.2024.121001
https://doi.org/10.1007/s12010-017-2639-5
https://doi.org/10.1128/MRA.00603-20
https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2018.12.038
https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2021.112767
https://doi.org/10.27674/d.cnki.gcyku.2022.001159
https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2013.07.036
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https://doi.org/10.1007/s00284-006-0487-6
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https://doi.org/10.1016/j.fsi.2017.11.020
https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2014.11.096
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https://doi.org/10.13344/j.microbiol.china.230530, 2023-11-20.