患脑膜炎病的和健康的棘胸蛙(40 ± 5 g)均来自浙江丽水某养殖场。健康棘胸蛙暂养于水族箱(70 cm × 53 cm × 57 cm)内，驯化7 d后用于后续实验。

取症状典型、濒死的棘胸蛙，体表消毒后，在无菌条件下，取病蛙脑、眼等组织于LB (Luria Bertani)琼脂培养基平板上划线接种，28℃下培养24 h后挑取形态大小一致优势菌落连续划线3次进一步纯化，接种纯化单菌落于LB培养基中，28℃摇床恒温培养24 h，加20%无菌甘油，−70℃保存备用。

将获得的3株优势纯化菌株接种于LB平板，28℃恒温培养24 h，用0.65%无菌生理盐水洗下，麦氏比浊法将细菌浓度调整为1.0 × 10⁹CFU/mL。将驯化7 d后的健康蛙随机分4组(10只/组)，感染组每只以1.0 × 10⁹CFU/mL浓度的菌悬液肌肉注射0.2 mL，对照组则注射相同剂量的0.65%无菌生理盐水，注射后每天观察记录发病症状和死亡情况，连续观察15 d，并及时剖检濒临死亡的个体，对病原菌再次分离纯化。

药敏试验参照CLSI抗微生物药物敏感性实验执行标准，采用Kriby-Bauer纸片扩散法进行20种常用抗菌药物的敏感性测定 [ 17 ] ，抑菌圈直径小于10 mm为不敏感或低度敏感，10~15 mm为中度敏感，大于15 mm为高度敏感。抗生素药敏试纸购自杭州天和微生物试剂有限公司。

根据QSM02的gyrB和blaB序列，设计扩增特异性片段的引物。blaB8F：5'-GTGCAGGAGGT TTGGAATA-3'，R：5'-CCATACCACTACATTGTCAG-3'、gyrB1F：5'-AATAGGAGACAGCGACA-3’，R：5'-AGTTTTCCTGGTAGTCC-3'。对双重PCR反应中Mg²⁺浓度、退火温度进行优化并对引物特异性进行检验，以确定适宜引物和最佳反应条件 [ 18 ] 。

选择致病性最强的QSM02菌株用于制备浓度为1.0 × 10⁹CFU/mL的甲醛灭活疫苗，经平板涂布法和肌肉注射攻毒来检测其安全性。试验分注射组、浸泡组、喷雾组和对照组(20只/组)。注射组为每只肌肉注射1.0 × 10⁹CFU/mL的疫苗0.2 mL；浸泡组为连续3 d每天用2.0%的1.0 × 10⁹CFU/mL疫苗浸泡30 min；喷雾组为连续3 d每天喷1.0 × 10⁹CFU/mL的疫苗于蛙体30 min；对照组为每只肌肉注射0.2 mL的0.65%无菌生理盐水。免疫后每10 d每组随机取3只蛙制备血清，用96孔U型板测定平均凝集抗体效价 [ 19 ] ，抗原为1.0 × 10⁹CFU/mL的活菌，抗体为免疫血清。在35℃条件下孵育l h，再置于4℃冰箱中过夜，翌晨判定其结果。免疫第30 d后，以1.0 × 10⁹CFU/mL的活病原菌进行攻毒，连续观察15 d记录发病症状及死亡情况。相对免疫保护率(Relative Percentage of Survival, RPS)：RPS(%) = (1 − 免疫组死亡率/对照组死亡率) × 100%

患病棘胸蛙体表皮肤发黑，头部歪向一侧，食欲不振，行动迟缓，胃肠无食并伴有部分白内障、肝病变的情况。

图1. 分离菌对棘胸蛙的人工感染结果

肌注分离所得三株菌的病蛙均不同程度地表现出头颈歪斜、身体失衡或旋游等脑膜炎症状。在攻毒24 h后，实验组蛙出现行动迟缓。QSM02组在48 h后出现死亡，感染6 d内全部死亡。QSM01组和QSM03组在36 h后出现死亡，感染15 d内全部死亡，对照组全部存活。从人工感染发病死亡的棘胸蛙体内再次分离细菌，其形态、理化特性与16S rDNA序列与接种菌株一致，说明这三株菌株均为致病菌，且QSM02菌致病性最强(图1)。

选用了20种抗生素对致病菌的药敏试验(表2)，QSM01菌株对新生霉素、恩诺沙星等5种抗生素敏感，对氯霉素、新霉素等5种抗生素中度敏感；QSM02菌株对新生霉素、红霉素、利福平敏感，对氯霉素、链霉素和万古霉素中度敏感；QSM03菌株对新霉素、万古霉素等6种抗生素敏感，对头孢拉定、四环素等5种抗生素中度敏感。

表2. 抗生素类药敏试验结果

Notes: R. resitance; I. intermediate; S. sensitive.

注：R耐药；I中度敏感；S敏感。

最佳的反应体系为：Taq Master Mix 10 μL，blaB8、gyrB1的上下引物各1 μL，8.07 ng/uL的DNA模板1 μL，5 μL无菌水。最佳反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，56℃复性1 min，72℃延伸45 s，共35个循环；7℃延伸7 min，Mg²⁺浓度为25 mg/L。QSM02扩增出789 bp的gyrB基因和200 bp的blaB8基因2条清晰的目的条带，阴性对照中的QSM01、QSM03只扩增出200 bp的blaB8基因条带，温和气单胞菌和嗜水气单胞菌均未扩增出blaB8和gyrB1的特异性条带(图4)。本次实验表明建立的QS02双重PCR检测方法具有较强的特异性。

将疫苗涂布于LB平板培养16~24 h 后，观察到培养基上均无细菌生长，表明疫苗没有细菌污染且已彻底灭活，同时肌肉注射结果表明，所有注射疫苗和生理盐水的健康棘胸蛙在15 d内均活动正常，进一步说明该疫苗对棘胸蛙是安全的。通过不同途径对棘胸蛙接种疫苗后，其血清凝集抗体效价相对于对照组均逐渐上升。注射组中在第20 d时达到最高血清凝集抗体效价，注射组效价最高(1:64~128)，一直延续到第30 d。而浸泡组和喷雾组最高血清凝集抗体效价出现较晚(表3)，使用浸泡免疫法和喷雾免疫法需要更长的时间来发挥较好的免疫保护作用。

图4. 双重PCR特异性实验结果

表3. 血清凝集抗体效价

表4. 棘胸蛙活菌攻毒后免疫保护力

在接种疫苗后的第30 d后进行攻毒，观察15 d后，对照组全部死亡，浸泡组死亡1只，喷雾组死亡2只，注射组全部存活。表明免疫组蛙体都具有一定的抗病力，注射免疫、浸泡免疫、喷雾免疫的免疫保护率分别达100%、87.5%、75%，其中注射组的免疫保护力最高(表4)。

根据现有报道，伊丽莎白菌属(Elizabethkingia sp.)是导致蛙类患脑膜炎的主要病原。如从患脑膜炎虎纹蛙(Rana tigerina) [ 7 ] 、黑斑蛙(Rana nigromaculata) [ 10 ] 、牛蛙(Rana catesbeiana) [ 5 ] 、美国青蛙(Rana grylio) [ 6 ] 、非洲爪蟾(Xenopus laevis) [ 20 ] 等体内分离出的致病菌均为脑膜炎败血伊丽莎白菌，又如从患病黑斑蛙 [ 21 ] 、北美豹蛙(Lithobates pipiens) [ 22 ] 、牛蛙 [ 23 ] 体内分离出的致病菌为米尔伊丽莎白菌(Elizabethkingia miricola)。此外，发现肺炎克雷伯菌 [ 2 ] 、嗜水气单胞菌 [ 3 ] 也可能导致蛙类出现该疾病。本研究从浙江丽水地区养殖场棘胸蛙脑组织中共分离出三个菌株，根据回归感染实验均三株菌均会导致不同程度的脑膜炎症状，但三者对蛙的致死时间和致死率方面存在差异，如QSM01组和QSM03组大约在36 h后出现死亡，感染15 d内全部死亡，而QSM02组在48 h后出现死亡，感染6 d内全部死亡(图1)，说明这三株菌株均为致病菌，且QS02菌致病性最强。利用两种分子标记对三株菌进行了鉴定，其中16S rRNA基因是细菌鉴定、分类及系统发育分析研究中最常用的标记，由于16S rRNA自身的局限性，很多情况下只能将细菌鉴定到属水平，而gyrB基因具有进化速率快、碱基替换频率高等优点，能够更好地对细菌在种水平上的鉴定 [ 24 ] 。通过这两种分子标记的共同鉴定，最终确定QSM01菌为朱斯特金黄杆菌(C. joostei)，QSM02菌为脑膜炎败血伊丽莎白菌(E. meningoseptica)，QSM03菌为比目鱼金黄杆菌(C. scophthalmum)。关于棘胸蛙歪头病、白内障等症状及病原鉴定已有相关报道。如雷雪平等 [ 8 ] 从四川雅安场殖养暴发白内障、体表溃疡的棘胸蛙体内鉴定出了脑膜炎败血伊丽莎白菌，又如本实验室成员也从丽水地区其他养殖场患歪头病棘胸蛙体内分离出的三株细菌，经鉴定也均为脑膜炎败血伊丽莎白菌 [ 9 ] 。由此可见，虽然引起棘胸蛙脑膜炎的细菌菌种类是多样的，但脑膜炎败血伊丽莎白菌是最为广泛的致病菌，而且感染此菌后棘胸蛙出现的病症也存在一定差异，这可能与病症或菌株差异有关。

双重PCR与常规单基因PCR相比，是在一个反应体系中添加两对不同的引物，扩增不同基因片段，从而实现同时检测多种病原或进行病原的不同类型检测。当前，双重PCR被广泛用于病原学分类鉴定、流行病学调查、早期诊断等方面，具有灵敏度高、特异性强、省时省力等优点 [ 25 ] 。本研究利用QSM02菌株的gyrB和blaB基因设计了特异性引物，通过多次对PCR体系反应条件进行优化，建立了双重PCR检测技术。QSM02扩增出了789 bp的gyrB基因和200 bp的blaB8基因2条清晰的目的条带，QSM01、QSM03只扩增出200 bp的blaB8基因条带，温和气单胞菌和温和气单胞菌均未扩增出blaB8和gyrB1的特异性条带，表明本研究建立的双重PCR具有高度特异性，显著提高了检测方法的真实可靠性。

本研究用20种常用抗菌药物对浙江丽水养殖场患脑膜炎棘胸蛙脑组织分离出的QSM02菌株进行药敏试验，发现该菌株仅对新生霉素、红霉素、利福平三种药物敏感，对氯霉素、万古霉素、恩诺杀星等5种药物中度敏感，对新霉素、庆大霉素、诺氟沙星等药物有耐药性。本实验室成员 [ 9 ] 在2016年在同地区患病棘胸蛙上分离的菌株对头孢哌酮、红霉素、庆大霉素和万古霉素敏感，本实验的菌株对万古霉素和庆大霉素的敏感性降低甚至产生耐药性，这可能是在实际养殖中过量采用这类抗菌药物导致，使丽水地区养殖场中的病原菌对一些常用抗生素产生一定程度的耐药性。从其他地区如浙江温州患病棘胸蛙上分离得到的脑膜败血伊丽莎白菌株PY-SW1506 [ 11 ] 对万古霉素、恩诺沙星、氧氟沙星、利福平等7种药物敏感，对青霉素、头孢氨苄、诺氟沙星、庆大霉素、呋喃妥因等15种药物表现出耐药性。利福平、万古霉素、恩诺沙星对同为浙江地区的QSM02菌株和PY-SW1506菌株有良好的抑菌作用，但四川雅安患病棘胸蛙上分离得到的脑膜败血伊丽莎白菌株CM160701仅对氟苯尼考敏感，对阿莫西林、头孢唑林、恩诺沙星、庆大霉素、红霉素等15药物表现出耐药性，这可能是同一物种的不同地域的分离株耐药性可能不同。此外本实验分离所得同样能使棘胸蛙患脑膜炎的QSM01和QSM03菌株同为金黄杆菌属，对大多数药物有耐药性，仅环丙沙星、恩诺沙星、利福平、万古霉素、新霉素5种药物对其均有较好的抑菌作用。这与Michel [ 26 ] 从其他水产源获得的67株金黄杆菌中，多数菌株表现出多种抗生素耐药性结果相同。因此在实际养殖中要有针对性、交替式地使用不同类别的抗生素或者采用专用疫苗等绿色防治手段。

疫苗防治已成为国内外水产动物病害防治的重要方向。周冬仁等 [ 27 ] 从患病牛蛙上分离鉴定出的无乳链球菌加弗氏佐剂制成甲醛灭活全菌疫苗，通过肌肉注射免疫对健康牛蛙的相对免疫保护率为67%；宋婷婷 [ 28 ] 将分离鉴定的鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)制成甲醛灭活疫苗，通过注射免疫对棘胸蛙烂皮病相对免疫保护率达到了75%。周末等 [ 29 ] 利用分离出的嗜水气单胞菌采用热灭活的方式制备疫苗，通过不同途径免疫对林蛙(Rana temporaria)红腿病的相对免疫保护率达到了47%到76%。胡成钰等 [ 30 ] 利用嗜水气单胞菌和乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)制备灭活疫苗，对牛蛙红腿病的相对免疫保护率在75%以上。周永灿等 [ 1 ] 用分离鉴定的脑膜炎败血伊丽莎白菌制成甲醛灭活疫苗，对虎纹蛙白内障的相对免疫保护率达到了95%。本研究针对棘胸蛙脑膜炎致病性最强的QSM02菌株制备甲醛灭活疫苗，相对免疫保护率均达到75%以上。疫苗免疫方式的不同在很大程度上影响了动物机体的免疫保护效果以及疫苗的推广使用 [ 31 ] [ 32 ] 。本实验注射组的免疫效果最佳，凝集效价为1:64~128，且可一直延续到第30 d，虽然见效快，但在规模化养殖中使用极为不便，并且不能对蝌蚪进行免疫保护。棘胸蛙的体表皮肤上有许多粘液腺，具有吸收疫苗和辅助呼吸的能力，因此采用浸泡免疫法和喷雾免疫法在实际生产中有更高的可行性。胡霭臻等 [ 33 ] 、周永灿等 [ 1 ] 研究表明喷雾免疫法较注射免疫法的最高凝集抗体效价出现较晚，但都有较好的免疫保护效果。本实验中浸泡组和喷雾组均在第30 d出现最高凝集抗体效价，且相对免疫保护率达到87.5%和75%，这种操作便捷，且对棘胸蛙无损伤的免疫更适合于实际应用。