目的：本研究旨在优化孔雀粪样中菌群基因组DNA的提取方法，以便为后续的研究奠定基础。方法：从野生动物园和圆通山动物园采集孔雀粪样，基于粪样用量、杂质去除方法和消化酶的添加等角度优化了孔雀粪样宏基因组DNA的提取方法，并通过16S rDNA基因和ERIC的PCR扩增验证了纯化DNA的效果。结果：采用0.5 g孔雀粪样、利用丙酮和乙醇交替漂洗样品及消化液中添加CTAB是提取孔雀肠道宏基因组DNA的优化关键点，通过该方法提取的DNA可用于后续的PCR扩增。结论：根据优化的方法可有效地提取孔雀粪样中的基因组DNA，研究结果为孔雀肠道菌群的研究奠定了基础。 Objective: The aim of this study is to optimize the extraction method of genomic DNA of microbiota from peacock feces, so as to lay a foundation for follow-up researches. Methods: The dung samples from Pavo were collected from the Wildlife Park and Yuantongshan Zoo in Yunnan province. The extraction method of metagenomic DNA from peacock dung samples was optimized based on the sampling amount of dung, the methods of impurity removal and the addition situation of digestive enzymes, et al . The effect of DNA purification was verified by PCR amplification of 16S rDNA gene and ERIC. Results: The key points for the optimization of extracting metagenomic DNA from peacock gut were using 0.5 g peacock fecal sample, rinsing the sample alternately with acetone and ethanol and adding CTAB to the digestive fluid. The DNA extracted by this method could be used for subsequent PCR amplification. Conclusion: The genomic DNA could be effectively extracted from peacock feces using the optimized method in this study, and the results would have laid a foundation for the research of peacock intestinal microbiota.
目的：本研究旨在优化孔雀粪样中菌群基因组DNA的提取方法，以便为后续的研究奠定基础。方法：从野生动物园和圆通山动物园采集孔雀粪样，基于粪样用量、杂质去除方法和消化酶的添加等角度优化了孔雀粪样宏基因组DNA的提取方法，并通过16S rDNA基因和ERIC的PCR扩增验证了纯化DNA的效果。结果：采用0.5 g孔雀粪样、利用丙酮和乙醇交替漂洗样品及消化液中添加CTAB是提取孔雀肠道宏基因组DNA的优化关键点，通过该方法提取的DNA可用于后续的PCR扩增。结论：根据优化的方法可有效地提取孔雀粪样中的基因组DNA，研究结果为孔雀肠道菌群的研究奠定了基础。
孔雀，粪样，菌群，基因组DNA，提取
Fen Tao, Yusha Jiang, Qi Liao, Kuowei Xu, Rui Miao, Lang Zhao, Jialiang Sun, Bo Shao, Peifu Wu*
College of Life Sciences, Southwest Forestry University, Kunming Yunnan
Received: Apr. 27th, 2022; accepted: Jun. 5th, 2022; published: Jun. 14th, 2022
Objective: The aim of this study is to optimize the extraction method of genomic DNA of microbiota from peacock feces, so as to lay a foundation for follow-up researches. Methods: The dung samples from Pavo were collected from the Wildlife Park and Yuantongshan Zoo in Yunnan province. The extraction method of metagenomic DNA from peacock dung samples was optimized based on the sampling amount of dung, the methods of impurity removal and the addition situation of digestive enzymes, et al. The effect of DNA purification was verified by PCR amplification of 16S rDNA gene and ERIC. Results: The key points for the optimization of extracting metagenomic DNA from peacock gut were using 0.5 g peacock fecal sample, rinsing the sample alternately with acetone and ethanol and adding CTAB to the digestive fluid. The DNA extracted by this method could be used for subsequent PCR amplification. Conclusion: The genomic DNA could be effectively extracted from peacock feces using the optimized method in this study, and the results would have laid a foundation for the research of peacock intestinal microbiota.
Keywords:Pavo, Fecal Sample, Microbiota, Genomic DNA, Extraction
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动物粪便来自于动物对机体消化残留物的排泄，其中含有大量的肠道微生物和宿主细胞，亦即动物粪便中含有大量蕴含肠道微生物组和宿主自身的DNA信息。鉴于此，动物粪便不断受到了国内外学者的广泛关注，并进行了系列相关研究：利用野生动物粪便中的宿主DNA进行动物遗传多样性、种群社会结构、种群数量等方面的研究 [
在动物粪便的研究过程中涉及的一个核心点是有效地提取粪样中的DNA，这直接决定了后续研究的成败和研究结果的准确性。研究表明，动物种类和采食习性不同时，提取其粪便DNA的难易程度也会存在明显的差异。当前，基于动物粪样宏基因组DNA的研究中主要涉及的宿主来源有人 [
孔雀粪样采集于云南省野生动物园和圆通山动物园，其中，从云南省野生动物园采集了120份粪样，从圆通山动物园采集了19份粪样。样品采集于2021年8月，采集样品时遵循了以下注意事项：1) 采集新鲜、无明显污染的粪样；2) 无菌采集，采集高压灭菌的50 mL离心管来收集样品；3) 原则上采集不同个体的粪样，但动物园孔雀以散养模式为主，无法做到粪样与个体间的对应，故采用分散样地采样法，即在孔雀活动的不同区域采样，在一定程度上可避免同一个体的重复采样；4) 采集成形的独立粪样，不采集已混合的粪样，一个粪样一个离心管；5) 样品采集后即时送回实验室，−20℃保存备用。
消化液I (20 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L EDTA)；消化液II (20 mg/mL CTAB, 81.82 mg/mL NaCl, 100 mmol/L Tris-HCl, 10 mmol/L EDTA)；溶菌酶(北京百泰克生物技术有限公司)；10%十二烷基磺酸钠；丙酮和无水乙醇。
在每份样品中，剔除表面可能被污染的部分，称取2 g粪样，置于50 mL无菌离心管内，做如下处理：1) 加入20 mL灭菌的PBS缓冲液，充分混匀，300 rpm/min离心3 min，将液相转入另一无菌的50 mL离心管内；2) 将沉淀物如前述重复处理，合并两次液相；3) 将收集液9000 rpm/min离心8 min，弃去液体，收集沉淀；4) 向沉淀中加入1 mL无水乙醇，充分混匀，6000 rpm/min离心5 min，弃去液体，收集沉淀；5) 向沉淀中加入1 mL丙酮，充分混匀，洗涤1 min，6000 rpm/min离心5 min，弃去液体，收集沉淀；6) 重复步骤(4)和(5)至洗涤液透明；7) 用PBS漂洗沉淀2次，加入5 mL无水乙醇，充分混匀，按1 mL混悬液分装于2 mL离心管内，置于−80℃保存。
参考以往报道的提取方法，并在这些方法的基础上进行了改进。简而言之，提取方法如下：1) 重悬保存样品，6000 rpm/min离心5 min，沉淀菌体，用PBS漂洗2次；2) 用8倍稀释的消化液II (200 μL)漂洗沉淀；3) 用PBS再次漂洗；4) 加入180 μL TE缓冲液、40 μL溶菌酶和20 μL蛋白酶K (20 mg/mL)，充分混匀，37℃水浴30 min，而后55℃水浴振荡消化2 h；5) 加入300 μL消化液I和70 μL 10% SDS，充分混匀，于55℃水浴30 min；6) 12,000 rpm/min离心5 min，收集上清，移入干净的1.5 mL离心管内；7) 用酚氯仿法纯化DNA。260 nm和280 nm波长下测定提取DNA的吸光值，根据OD260/OD280比值分析DNA的纯度。
在基因组DNA提取过程中，本研究从以下几个方面进行了优化改进：1) 分别采用0.1 g、0.25 g、0.5 g、1 g、2 g、3 g和4 g粪样来提取DNA；2) 6层纱布过滤去除粪样大杂质，或采用差速离心法去除杂质；3) 去除可溶性杂质方面，分别采用PBS多次漂洗、乙醇多次漂洗、乙醇和丙酮交替漂洗来去除杂质；4) 消化液中含CTAB或不含CTAB；5) 添加溶菌酶或不添加溶菌酶；6) 70 μL、80 μL、90 μL和100 μL 10% SDS的添加量。
为了验证提取的DNA能否用于PCR扩增，本研究采用两对引物，分别对16S rDNA基因和肠杆菌基因间重复一致序列(ERIC)进行了扩增。
采用27F和1492R引物来扩增微生物组16S rDNA基因。扩增体系为：上下游引物(10 µmol/L)各1 µL；Taq酶1 µL；10× Taq Buffer 2.5 µL；dNTP Mixture (2.5 mM) 2 µL；模板2 µL；牛血清白蛋白(BSA) 0.1 µL；ddH2O为15.4 µL。扩增反应程序为：94℃ 5 min；30个循环程序(94℃ 30 s，55℃ 1 min，72℃延伸1 min)；72℃总延伸6 min。
采用引物R1(5'-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3')和R2(5'-AAGTAAGTGACTGG GGTGAGCG-3')进行ERIC-PCR扩增，扩增体系同上，反应程序为：94℃ 5min；35个循环程序(94℃ 30 s，40℃ 1 min，72℃延伸1 min)；72℃总延伸6 min。
配置1%的琼脂糖凝胶，吸取5 µL PCR产物，加入凝胶孔内，在120 V在电泳仪上电泳检测PCR产物。
采用R语言vcd包进行相应的统计和作图。
基于改进的方法，本研究成功地提取了孔雀肠道菌群的宏基因组DNA (图1(a))。经凝胶电泳，观察到提取DNA的大小约为24 kb左右。
提取宏基因组DNA时，粪样的采用量对DNA提取效果具有明显的影响：当粪样量为0.1 g时，本研究未观察到明显的电泳条带；当粪样量为0.25 g时，提取DNA的条带很弱或有时观察不到条带，DNA的提取效果不稳定；当粪样量为0.5 g、1 g和2 g时，均能观察到明显的DNA条带，但随着样品量的增加，在DNA迁移的琼脂上逐步出现明显的杂质干扰现象，即在DNA条带附近出现拖尾现象，且样品量为2 g时纯化的DNA液带有颜色；当粪样量在3 g和4 g时，杂质干扰现象进一步增加，甚至影响DNA的提取效果。
在去除大杂质方面，6层纱布过滤与差速离心具有同等效应，两者间无明显的差别。
在去除可溶性杂质方面，PBS多次漂洗、乙醇多次漂洗、乙醇和丙酮交替漂洗对DNA提取效果也具有明显的影响：采用PBS多次漂洗后，尽管漂洗液呈透明无色，但纯化的DNA液携带明显的颜色；乙醇多次漂洗后，虽然纯化DNA液的颜色变淡，但电泳时仍有较明显的杂质干扰现象；乙醇和丙酮交替漂洗后，纯化DNA液的颜色明显变淡，电泳后的杂质干扰现象明显减少。
CTAB的添加与否会影响纯化DNA液中可溶性杂质的含量：当使用含CTAB的消化液II时，纯化DNA液的颜色呈透明色，电泳后的杂质干扰现象明显减少；不使用CTAB时，情况刚好相反。
溶菌酶的添加与否会影响纯化DNA的得率：用溶菌酶消化后，可观察到明显的基因组DNA条带；不使用溶菌酶时，DNA的得率下降。
增加10% SDS的添加量会明显干扰DNA的提取过程：除70 μL外，其它添加量的SDS均可致消化液中析出白色絮状化合物，但向消化液中添加NaCl，可使絮状化合物逐步溶解。
基于上述结果的对比和分析，本研究最终建立了上述方法中所述的孔雀粪样宏基因组DNA提取方法。
利用通用引物27F和1492R，从提取的DNA中扩增微生物组16S rDNA基因，本研究成功扩增了16S rDNA基因，条带大小与预期的大小一致，为1400 bp左右(图1(c))。
利用R1和R2引物从宏基因组DNA中扩增出了不同大小的条带，条带大小类型有250 bp、400 bp、550 bp、800 bp、1000 bp、1200 bp、1500 bp、1750 bp、2000 bp、2800 bp和3000 bp (图1(b))。整体而言，400 bp和550 bp条带是扩增的优势条带，分别占总样品数的95.68%和55.40%，其次为800 bp、1000 bp和1200 bp，分别占总样品数的7.19%、17.99%和8.63%。野生动物园和圆通山动物园的样品具有不同的ERIC扩增特征(图2(a))，但在热点聚类中两者未形成明显的单独聚类。野生动物园样品与圆通山动物园相比，圆通山动物园样品中550 bp、1000 bp和1750 bp的扩增率明显高于野生动物园(圆通山动物园样品中分别为89.47%、47.37%和15.79%；野生动物园样品分别为50%、13.33%和0%)，其它条带未见明显的差异(图2(b)和图2(c)，图中横坐标的标注从左到右分别为250 bp、400 bp、550 bp、800 bp、1000 bp、1200 bp、1500 bp、1750 bp、2000 bp、2800 bp和3000 bp)。
图1. 本研究中DNA提取或PCR扩增产物电泳图。(a)为部分粪样菌群基因组DNA的电泳图；(b)为部分样品ERIC-PCR产物的电泳图；(c)为16S rDNA基因扩增产物的电泳图
从单一样品中的扩增条带总数来看，扩增条带数的范围为1~4条(图2(d)和图2(e))。野生动物园中条带数1、2、3和4分别占该来源样品总数的36.67%、32.50%、23.33%和3.33%，但圆通山动物园中未发现有4条扩增带的样品，而条带数1、2和3分别占该来源样品总数的5.26%、31.58%和63.16%。
肠道菌群含有大量的生物学信息，作为人和动物的“新型器官”，在人和动物的生长发育、动物生产形状、疾病发生等方面具有非常重要的意义 [
粪样菌群宏基因组DNA提取效果受多种因素的影响，如动物的种类、粪样采集方法、粪样保存方法、粪样保存时间等。当前报道的粪样保存方法包括：低温保存、福尔马林保存、硅珠保存、DETs (DMSO/EDTA/Tris盐溶液)保存、干燥保存和乙醇保存等 [
动物粪便中所含杂质的种类可能随动物种类的不同而存在差异，主要取决于动物的生活环境、饮食行为、健康状态等。动物粪便中不仅含有源自动物宿主自身的体细胞，而且含有肠道微生物、食物残渣、胃肠道分泌的各种酶、胆碱、胆红素、黏多糖类物质、脲、腐殖酸、食源性植物的多糖、多酚、萜类等物质，其中，酶、胆碱、胆红素、多糖、多酚和萜类等物质均易致使DNA发生降解，影响肠道菌群DNA提取的产量和质量，进而影响后期的PCR扩增 [
图2. ERIC-PCR扩增条带的分布特征。(a)为不同类型条带扩增结果的热点图；(b)和(c)为不同大小条带的扩增率；(d)和(e)为单一样品中扩增条带数占来源样品总数的百分比
乙醇交替漂洗和PBS漂洗的方法，能够明显地减少粪样组织中的可溶性和不可溶性杂质成份，为成功提取宏基因组DNA做了铺垫。CTAB可与蛋白质和大多数的多糖结合形成复合物，有助于DNA与多糖分开。在后续的酚氯仿纯化过程中，还可去除一定量的蛋白质、多糖和糖脂等干扰杂质。总而言之，通过本研究所采取的方法可有效地提取孔雀粪样中的宏基因组DNA，提取的DNA可用于后续的PCR扩增分析，这点通过16S rDNA基因和ERIC的扩增得到了验证。此外，还可以用纯化柱来替代酚氯仿纯化步骤，这样可更加有效地去除粪样杂质的干扰。
ERIC-PCR主要针对肠杆菌基因间重复一致序列，常用于流行菌株间的区分和致病菌的流行病学调查，用于粪样宏基因组DNA时，可有助于区分不同个体肠道菌群组成间的差异。从本研究可以看出，野生动物园和圆通山动物园的孔雀在肠道菌群的结构上有非常高的相似性，但也存在一定的个体间差异。
西南林业大学大学生创新训练计划项目(202010677092)；云南省教育厅科学研究基金项目(2022J0505)。
陶 芬,姜玉莎,廖 琦,徐扩卫,苗 睿,赵 浪,孙 嘉良,邵 博,吴培福. 孔雀粪样宏基因组DNA提取方法的优化 Optimization of Extraction Method of Metagenomic DNA from Pavo Fecal Samples[J]. 生物过程, 2022, 12(02): 99-105. https://doi.org/10.12677/BP.2022.122011
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https://doi.org/10.1186/s13756-019-0645-9
https://doi.org/10.1186/s40168-020-00941-7
https://doi.org/10.1128/AEM.00165-11
https://doi.org/10.1271/bbb.69.1793
https://doi.org/10.4314/ovj.v9i3.10