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Bioprocess

2164-5566

Scientific Research Publishing

10.12677/BP.2021.114015

BP-46943

BP20210400000_35258537.pdf

生命科学

细胞面积与风疹单次病毒收获液病毒滴度关系的探讨 Study on the Relationship between Cell Area and Virus Titer of Rubella Virus Single Harvest Fluid

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北京民海生物科技有限公司，北京

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20102021

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2014

This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

目的：探讨细胞面积与风疹单次病毒收获液病毒滴度的关系。方法：使用不同细胞面积接种风疹病毒，制备风疹单次病毒收获液，进行病毒滴定。结果：不同细胞面积制备的风疹单次病毒收获液病毒滴度没有差异。结论：在一定范围内，细胞面积与风疹病毒滴度不存在正比关系。 Objective: To investigate the relationship between cell area and virus titer of rubella virus single harvest fluid. Method: Rubella virus was inoculated in different cell areas to prepare rubella virus single harvest fluid for virus titration. Result: There was no difference in virus titer of rubella virus single harvest fluid from different cell areas. Conclusion: In a certain range, there was no direct correlation between cell area and rubella virus titer.

细胞面积，病毒滴度，风疹单次病毒收获液, Cell Area Virus Titer Rubella Virus Single Harvest Fluid

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目的：探讨细胞面积与风疹单次病毒收获液病毒滴度的关系。方法：使用不同细胞面积接种风疹病毒，制备风疹单次病毒收获液，进行病毒滴定。结果：不同细胞面积制备的风疹单次病毒收获液病毒滴度没有差异。结论：在一定范围内，细胞面积与风疹病毒滴度不存在正比关系。

关键词

细胞面积，病毒滴度，风疹单次病毒收获液

Study on the Relationship between Cell Area and Virus Titer of Rubella Virus Single Harvest Fluid<sup> </sup>

Tong Xie, Zhong Zheng, Hongqiang Li, Li Wang, Siyuan Zhang, Dianli Gong

Beijing Minhai Biotechnology Co., Ltd., Beijing

Received: Oct. 19^th, 2021; accepted: Nov. 25^th, 2021; published: Dec. 2^nd, 2021

ABSTRACT

Objective: To investigate the relationship between cell area and virus titer of rubella virus single harvest fluid. Method: Rubella virus was inoculated in different cell areas to prepare rubella virus single harvest fluid for virus titration. Result: There was no difference in virus titer of rubella virus single harvest fluid from different cell areas. Conclusion: In a certain range, there was no direct correlation between cell area and rubella virus titer.

Keywords:Cell Area, Virus Titer, Rubella Virus Single Harvest Fluid

This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0).

http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

1. 引言

制备病毒类疫苗，目前普遍认为单个培养容器内细胞面积越大，病毒滴度越高，因此，发明了各种扩大细胞培养面积的容器及培养方法。从静止培养、旋转培养、细胞工厂培养到反应器培养等。本试验数据表明：单个培养容器内细胞面积在一定范围内，并不是面积越大，病毒滴度就越高，它们之间不存在正比关系，本文就此做一报道。

2. 材料与方法

风疹单次病毒收获液制备分为MRC-5细胞复苏、传代培养、洗换、接种病毒、单次病毒收获液收获等步骤。合格的单次病毒收获液配制原液、半成品，半成品分装、冻干，制备疫苗成品。通过使用不同细胞培养容器、不同工艺制备风疹单次病毒收获液，来说明不同细胞面积培养病毒对病毒滴度的影响。

2.1. MRC-5细胞和风疹病毒RA27/3株

购自美国ATCC。

2.2. 复苏液和培养液

复苏液为20%新生牛血清MEM液，NaHCO₃调至适宜pH值，用于细胞复苏。培养液为10%新生牛血清MEM液，NaHCO₃调至适宜pH值，用于细胞传代培养。新生牛血清购自浙江天杭生物科技股份有限公司。MEM购自上海源培生物科技股份有限公司。NaHCO₃购自自贡鸿鹤制药有限责任公司。

2.3. 维持液

用于病毒培养。199培养基溶液，NaHCO₃调至适宜pH值，用于静止培养与旋转培养的比较。MEM液，NaHCO₃调至适宜pH值，用于旋转培养与细胞工厂培养的比较。199培养基和MEM培养基均购自上海源培生物科技股份有限公司。

2.4. 培养瓶

5 L瓶静止培养细胞面积为600 cm²，5 L瓶旋转培养细胞面积为1500 cm²。5 L刻度血清瓶购自四川蜀玻集团有限责任公司。

2.5. 细胞工厂

10层细胞工厂细胞面积为6360 cm²。10层细胞工厂购自康宁公司。

2.6. MRC-5细胞复苏、传代培养

将26代细胞复苏，按1:2或1:4的比例传代至33代，分别接种5 L瓶(进行静止培养和旋转培养)和10层细胞工厂。静止培养是将5 L培养瓶放置到台面上，于37℃ ± 1℃进行培养，让细胞贴到瓶壁上生长，细胞在有培养液的瓶壁上生长，其面积为600 cm²。旋转培养是将5 L培养瓶放置转瓶机上，于37℃ ± 1℃进行培养。培养瓶随着转瓶机的运行而旋转，因此，称为转瓶，细胞就贴到瓶壁上生长，其面积为1500 cm²。细胞工厂培养是将10层细胞工厂，放置到37℃ ± 1℃进行静止培养，细胞贴到向上的面上生长，其面积为6360 cm²。

2.7. 5 L瓶静止培养与旋转培养的比较

细胞长成致密单层后，洗换，洗去牛血清，接种风疹病毒。5 L瓶接种病毒后，换入199维持液，进行静止培养与旋转培养(转瓶)。两种方法每瓶液量均为1500 mL，放置31℃ ± 1℃培养。定期观察细胞，根据细胞状态及病变形态，确定病毒液收获时间。

2.8. 5 L瓶旋转培养与10层细胞工厂培养的比较

细胞长成致密单层后，洗换，洗去牛血清，接种风疹病毒。5 L转瓶(旋转培养)与10层细胞工厂接种病毒后，换入MEM维持液，液量均为2000 mL，放置31℃ ± 1℃培养。定期观察细胞，根据细胞状态及病变形态，确定病毒液收获时间。

2.9. 单次病毒收获液收获

一般病毒培养6、2、1天分别进行收获，第一、二次收获后，换入新的维持液继续培养。将风疹病毒液加入稳定剂，即为单次病毒收获液，混合均匀，取样，进行病毒滴定。

5 L瓶静止培养与旋转培养的比较试验，两种方法单次病毒收获液收获时，病毒液与稳定剂的比例均为4:1，即每个5 L瓶每次可以收获单次病毒收获液1875 mL。

5 L瓶旋转培养与10层细胞工厂培养的比较试验，两种方法单次病毒收获液收获时，病毒液与稳定剂的比例均为4:1，即每个5 L转瓶和每个10层细胞工厂每次可以收获单次病毒收获液2500 mL。

2.10. 风疹单次病毒收获液病毒滴定

采用微量细胞病变法 [1]。

2.11. 统计学方法

资料的统计分析由Excel统计软件完成。

3. 结果 3.1. 5 L瓶静止培养与旋转培养的比较

5 L瓶静止培养与旋转培养制备风疹单次病毒收获液，病毒滴度结果“见表1”。

Table 1 Statistics of single virus harvest flui

批次	静止培养(lgCCID₅₀/ml)	旋转培养(lgCCID₅₀/ml)
1	5.2	5.5
2	5.1	5.4
3	5.0	5.3
4	5.3	5.6
5	5.3	5.5
6	5.7	5.4
7		5.3
8		5.1
9		5.0
10		5.1
11		5.5
12		5.5
13		5.1
14		5.3
15		5.0
16		5.0
17		5.2
18		5.3
平均	5.3 ± 0.2	5.3 ± 0.2

表1. 单次病毒收获液统计

由表1可见，两种方法制备的单次病毒收获液病毒滴度相同，经统计学分析，P值为0.867，>0.05，差别无显著性。

3.2. 5 L瓶旋转培养与10层细胞工厂培养的比较

5 L瓶旋转培养与10层细胞工厂培养制备风疹单次病毒收获液，病毒滴度结果“见表2”。

Table 2 Statistics of single virus harvest flui

批次	静止培养(lgCCID₅₀/ml)	旋转培养(lgCCID₅₀/ml)
1	6.1	5.5
2	6.2	5.6
3	5.3	5.4
4	5.7	5.6
5	5.3	5.5
6	5.6	5.5
7	6.0	5.7
8	6.0	5.6
9	5.5	5.6
10	5.2	5.7
11	5.3	5.6
12	5.5	5.4
13	5.7	5.7
14	5.8	5.6
15	5.4	5.3
16	5.5	5.6
17	5.6	5.6
18	5.0	5.3
平均	5.6 ± 0.2	5.5 ± 0.1

表2. 单次病毒收获液统计

由表2可见，两种方法制备的单次病毒收获液病毒滴度相差不大，经统计学分析，P值为0.551，>0.05，差别无显著性，即病毒滴度相同。

4. 讨论

病毒类疫苗生产使用细胞培养病毒，为了扩大产量，往往采取增加细胞面积的方法。增加细胞面积的方法，一个是增加培养容器的数量，一个是增加单个容器的细胞面积来实现。虽然增加培养容器的数量可以提高疫苗产量，但是此方法有一定的局限性，受制于厂房的规模，培养容器不可能无限增加，因此，又发明了增加容器培养面积的方法。将培养瓶从2 L、3 L发展到10 L、15 L。为了进一步增加单个容器的细胞面积，病毒培养从静止培养、旋转培养、细胞工厂培养到反应器培养 [2] - [7]。静止培养、旋转培养、细胞工厂培养属于一个级别的，细胞面积相差不是特别悬殊，而反应器培养细胞面积与其他培养方法相差就不是一个级别了，在此不做探讨。

风疹病毒培养，5 L瓶静止培养细胞面积为600 cm²，5 L瓶旋转培养细胞面积为1500 cm²，10层细胞工厂培养细胞面积为6360 cm²。5 L瓶旋转培养细胞面积是静止培养的2.5倍，病毒滴度没有差别；10层细胞工厂细胞面积是5 L瓶旋转培养的4倍多，病毒滴度也没有差别，由此可以推断10层细胞工厂培养与5 L瓶静止培养，病毒滴度没有差别。10层细胞工厂培养细胞面积是5 L瓶静止培养的10倍多，因此，单个培养容器细胞面积相差在10倍以内，与病毒滴度不存在正比关系，即不是细胞面积越大，病毒滴度就越高。10 L瓶旋转培养细胞面积为2130 cm²，是5 L瓶旋转培养细胞面积的1.4倍。本公司曾经使用10 L瓶旋转培养制备风疹单次病毒收获液，后来改为5 L瓶旋转培养制备风疹单次病毒收获液，多年生产中，病毒滴度及产量均没有降低，也验证了上述试验结果 [8]。

单个培养容器细胞面积相差10倍以内，细胞面积与病毒滴度不成正比关系的原因，有待于探讨。根据此试验结果，可以对现有病毒培养方法进行改良，既可以节省细胞，减少操作时间，降低污染风险，又可以增加单产，节约成本，提高效率。

文章引用

解通,郑仲,李宏强,汪立,张思远,公殿力. 细胞面积与风疹单次病毒收获液病毒滴度关系的探讨 Study on the Relationship between Cell Area and Virus Titer of Rubella Virus Single Harvest Fluid[J]. 生物过程, 2021, 11(04): 134-139. https://doi.org/10.12677/BP.2021.114015

参考文献

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