AMS Advances in Marine Sciences 2376-4260 Scientific Research Publishing 10.12677/AMS.2021.84008 AMS-46132 AMS20210400000_67851101.pdf 地球与环境 红鳍东方鲀结合CCL25b核心启动子区转录因子的鉴定 Identification of Transcription Factors Binding the Core Promoter Region of CCL25b in Takifugu rubripes 尚 凤芹 2 1 李 岩 3 1 陆 芸 3 1 王 秀利 3 1 刘 洋 3 1 大连海洋大学水产与生命学院，辽宁 大连 大连海洋大学水产与生命学院，辽宁 大连；大连海洋大学海洋科技与环境学院，辽宁 大连 null 29 10 2021 08 04 69 81 © Copyright 2014 by authors and Scientific Research Publishing Inc. 2014 This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

基因转录调控一直是生物信息学研究的一个重要内容，转录因子与启动子区域上的特异性调控元件的结合在基因表达和调控中具有重要意义，是构建基因调控网络的一个核心问题。趋化因子配体25 (chemokine 25, CCL25)是一种属于CC趋化因子家族的小细胞因子，在免疫细胞调节和炎症过程如T细胞归巢和慢性组织炎症中均发挥重要作用。为了探究CCL25在表达过程中受到的转录调控机制，本实验我们初次采用聚合酶链式反应(PCR)扩增出红鳍东方鲀CCL25b的核心启动子区，并利用DNA pull down方法对结合在该序列的蛋白质进行富集，最后结合质谱鉴定数据及GO富集分析初步筛选出6个转录因子(C1QBP 、 PURA 、 ARHGAP35 、 NME2 、 RAP2C 和 DRG1 )，这些初步结果将有助于推进对与CCL25表达调节机制有关的潜在生物学过程的理解。 Gene transcriptional regulation has been an important element of bioinformatics research. The binding of transcription factors to specific regulatory elements on promoter regions is important in gene expression and regulation, and is a central issue in the construction of gene regulatory networks. Chemokine ligand 25 (CCL25) is a small cytokine belonging to the CC chemokine family that plays an important role in immune cell regulation and inflammatory processes such as T cell homing and chronic tissue inflammation. In order to investigate the transcriptional regulation mechanism of CCL25 in its expression, Polymerase chain reaction (PCR) was used to amplify the core promoter region of CCL25b in Takifugu rubripes , and then DNA pull down was used to enrich the proteins bound to this sequence. Finally, we combined the mass spectrometry identification data with GO enrichment analysis to initially identify six transcription factors ( C1QBP , PURA , ARHGAP35 , NME2 , RAP2C and DRG1 ), and these results will help advance the understanding of the underlying biological processes associated with the regulatory mechanism of CCL25 expression.

 启动子，转录因子，DNA pull down，质谱鉴定, Promoter Transcription Factor DNA pull down Mass Spectrometry Identification 摘要

基因转录调控一直是生物信息学研究的一个重要内容，转录因子与启动子区域上的特异性调控元件的结合在基因表达和调控中具有重要意义，是构建基因调控网络的一个核心问题。趋化因子配体25 (chemokine 25, CCL25)是一种属于CC趋化因子家族的小细胞因子，在免疫细胞调节和炎症过程如T细胞归巢和慢性组织炎症中均发挥重要作用。为了探究CCL25在表达过程中受到的转录调控机制，本实验我们初次采用聚合酶链式反应(PCR)扩增出红鳍东方鲀CCL25b的核心启动子区，并利用DNA pull down方法对结合在该序列的蛋白质进行富集，最后结合质谱鉴定数据及GO富集分析初步筛选出6个转录因子(C1QBP、PURA、ARHGAP35、NME2、RAP2C和DRG1)，这些初步结果将有助于推进对与CCL25表达调节机制有关的潜在生物学过程的理解。

 关键词

启动子，转录因子，DNA pull down，质谱鉴定

 Identification of Transcription Factors Binding the Core Promoter Region of CCL25b in Takifugu rubripes<sup> </sup>

Fengqin Shang1,2, Yan Li1, Yun Lu1, Xiuli Wang1, Yang Liu1*

1College of Fisheries and Life Science, Dalian Ocean University, Dalian Liaoning

2College of Marine Technology and Environment, Dalian Ocean University, Dalian Liaoning

Received: Sep. 22nd, 2021; accepted: Oct. 22nd, 2021; published: Oct. 29th, 2021

 ABSTRACT

Gene transcriptional regulation has been an important element of bioinformatics research. The binding of transcription factors to specific regulatory elements on promoter regions is important in gene expression and regulation, and is a central issue in the construction of gene regulatory networks. Chemokine ligand 25 (CCL25) is a small cytokine belonging to the CC chemokine family that plays an important role in immune cell regulation and inflammatory processes such as T cell homing and chronic tissue inflammation. In order to investigate the transcriptional regulation mechanism of CCL25 in its expression, Polymerase chain reaction (PCR) was used to amplify the core promoter region of CCL25b in Takifugu rubripes, and then DNA pull down was used to enrich the proteins bound to this sequence. Finally, we combined the mass spectrometry identification data with GO enrichment analysis to initially identify six transcription factors (C1QBP, PURA, ARHGAP35, NME2, RAP2C and DRG1), and these results will help advance the understanding of the underlying biological processes associated with the regulatory mechanism of CCL25 expression.

Keywords:Promoter, Transcription Factor, DNA pull down, Mass Spectrometry Identification

Copyright © 2021 by author(s) and beplay安卓登录

This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0).

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 1. 引言

趋化因子配体25 (chemokine 25, CCL25)是一种属于CC趋化因子家族的小细胞因子，也称为胸腺表达的趋化因子(TECK)。研究表明CCL25在T细胞的发育中起作用 [ 1 ]。在豚鼠骨关节炎模型中也被证实，关节内注射CCL25联合透明质酸可保护软骨免受蛋白多糖丢失和与膝关节软骨破坏相关的形态恶化 [ 2 ]。多项研究表明，趋化因子受体9 (chemokine receptor 9, CCR9)及其专用配体CCL25在多种恶性肿瘤中过表达，并与肿瘤的增殖、凋亡、侵袭、迁移和耐药密切相关 [ 3 ]。综上，CCL25在免疫细胞调节和炎症过程如T细胞归巢和慢性组织炎症中发挥重要作用。因此，全面了解CCL25表达及其活性的调控机制具有重要意义。

基因的转录是由被称为启动子的上游调控DNA的结构决定的。理解真核生物和原核生物的转录调控，需要对与感兴趣的启动子结合的调控蛋白进行鉴定。转录因子与启动子区域上的特异性调控元件的结合在基因表达和调控中至关重要 [ 4 ]。激活转录这一活动需要与DNA结合的反式激活子募集转录共激活因子或抑制子，以及众多与基础转录因子相互作用的相关蛋白，因而分析这些与DNA结合的大型蛋白质复合物是阐明调节基因表达机制的重要步骤 [ 5 ]。转录因子一般由两个功能结构域组成，一是DNA结合结构域，二是转录活化结构域。根据作用效果的差异，转录因子可分为转录抑制因子和转录激活因子两大类。当细胞中没有诱导物时，转录抑制因子可以与调控序列结合并使附近的启动子失去转录活性。一旦诱导物出现，抑制因子即从靶DNA区域脱离，同时启动子的转录活性恢复。而转录激活因子一般需要与效应配体相互作用才能实现其激活功能。根据启动子DNA结合位点的不同，抑制因子和激活因子之间是可以转化的 [ 6 ]。

目前，已有多种方法可用于DNA结合蛋白的检测和分离，比如：凝胶迁移实验(EMSA)、足迹实验(Foot-printing Assay)、干扰实验(Interference Assays)、染色质免疫共沉淀(ChIP)、DNA-蛋白质印迹杂交(Southwestern Blot)和DNA pull down等。而相较于以上所有的分离方法，DNA pull down的优点在于可以同时分析复合物中的大量蛋白质。Wu-Guo Deng等人将环氧合酶-2启动子作为探针，与核提取物孵育，最后通过免疫印迹评估复合物中的蛋白质，检测到一系列转录因子 [ 7 ]。为了探究蛋白混合物中的结合蛋白，质谱技术可以对蛋白质复合物进行更加深入地定量分析。Diem Hong Tran等人将DNA pull down与二维凝胶电泳和质谱分析相结合，鉴定了六种与人D-氨基酸氧化酶基因5’侧翼区域结合的蛋白质 [ 8 ]。该方法在确定反激活因子p300/CBP和相关蛋白与环氧化酶-2 (COX-2)启动子结合的调控方面同样被证明是有用的。

本实验中，我们使用PCR技术扩增获得了CCL25b的启动子序列，并成功制备了红鳍东方鲀脑和鳃组织总蛋白。通过DNA pull down技术获得了与CCL25b基因的启动子序列相互作用的蛋白，这些蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测并进行质谱鉴定分析。我们的结果首次报道了CCL25b基因启动子序列相互作用蛋白，这可能成为进一步研究CCL25b基因表达调控因子的潜在靶点之一。

 2. 材料与方法 2.1. 引物设计

本实验以红鳍东方鲀基因组DNA为模板，在NCBI数据库中检索CCL25b基因序列，确定出CCL25b的核心启动子区域，选取基因转录起始位点上游2000 bp及下游500 bp为靶序列进行巢式PCR反应以克隆启动子片段，利用Primer Primer5.0设计两对引物(表1)，其中CCL25bF1和CCL25bR1为CCL25b巢式PCR的外引物，CCL25bF2b和CCL25bR2U为CCL25b巢式PCR的内引物，UPL为具有生物素标记的特异性通用引物。CCL25bF1和CCL25bR1引物委托上海捷瑞生物工程有限公司合成并纯化，CCL25bF2b、CCL25bR2U和生物素标记的特异性通用引物委托华大基因合成并纯化。不同引物在基因CCL25b核心启动子区的定位如图1所示，其中TSS为转录起始位点。

Primer sequence
引物名称 引物序列(5’-3’) Tm (˚C)
CCL25bF1 GGTGTCGTCGTTATGAATCG 52.59
CCL25bR1 CAGGCTCACGTACATGCAG 54.12
CCL25bF2b GCAGTAGCGCGCAGTCGT 60.00
CCL25bR2U CCAGCGGCTTGACTGTCTGTGCAGCTTGTGGTG 71.57
UPL AGAGCATTGCGACCAGCGGCTTGAC 66.51

表1. 引物序列

图1. 启动子的克隆策略

 2.2. 基因组DNA的提取及启动子片段的标记

取适量红鳍东方鲀的肌肉组织，使用天根生化科技(北京)有限公司的DNA提取试剂盒(目录号：DP324)提取基因组DNA，提取的DNA置于−20℃冰箱保存备用。

以红鳍东方鲀基因组DNA为模板，使用外引物对进行普通PCR反应以克隆启动子片段，反应体系(20 μL)如表2。

PCR reaction syste
试剂名称 体积
10×buffer 2 μL
dNTPs 1.5 μL
Primers 0.5 μL
Template DNA 0.2 μL
rTaq 0.2 μL
ddH2O up to 20 μL

表2. PCR反应体系

反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸2 min 10 s，共进行34个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。

用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物条带大小是否正确，PCR产物条带检测合格后，使用天根生化科技(北京)有限公司的DNA凝胶回收试剂盒(目录号：DP209)回收纯化正确条带，实验步骤参照试剂盒所提供方法。

将回收到的基因片段作为二次PCR的模板，进行降落PCR反应以克隆带有生物素标记的启动子片段，反应体系(20 μL)如表3。

Touchdown PCR reaction syste
试剂名称 体积
长片段 短片段 阴性对照
2×phanta buffer 10 μL 10 μL 10 μL
dNTPs 0.4 μL 0.4 μL 0.4 μL
CCL25bF2b 1 μL 1 μL 1 μL
CCL25bR2U 1 μL 1 μL -
UPL 1 μL - 1 μL
模板DNA 1 μL 1 μL 1 μL
Phanta酶 0.4 μL 0.4 μL 0.4 μL
ddH2O up to 20 μL up to 20 μL up to 20 μL

表3. 降落PCR反应体系

反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，72℃退火与延伸1 min 30 s，共进行5个循环；94℃变性30 s，68℃退火30 s，72℃延伸1 min 10 s，共进行5个循环；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min 10 s，共进行25个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。

用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物条带大小是否正确，在检测产物条带大小正常的情况下，收集带有生物素标记的启动子片段并用天根生化科技(北京)有限公司的普通DNA产物纯化试剂盒(目录号：DP204)进行纯化，实验步骤参照试剂盒所提供方法。将纯化后带有生物素标记的启动子片段送至北京六合华大基因科技有限公司进行测序，使用NanoDrop2000 (Thermo Scientific, USA)进行浓度测定并置于−20℃保存以备下游实验。

 2.3. 活性组织总蛋白的制备

使用上海生工的《一步法动物组织活性蛋白提取试剂盒》(产品编号：C500006)提取红鳍东方鲀脑、鳃组织总蛋白。将提取得到的组织活性总蛋白用biosharp的BCA蛋白浓度测定试剂盒(产品编号：BL521A)及紫外分光光度计进行蛋白标准曲线的绘制并计算所提蛋白浓度，实验步骤参照试剂盒所提供方法。最后将所提活性蛋白分装并置于−80℃保存备用。

 2.4. 启动子–磁珠的结合

按照Streptavidin Magnetic Beads (New England BioLabs, USA. 目录号：S1420S)说明书中的磁珠与核酸的结合容量，每1 mg磁珠可结合500 pmol以上的单链25 bp生物素标记的寡核苷酸，结合2.2中测得的带有生物素标记的启动子片段浓度，将磁珠与生物素标记的启动子片段共孵育。首先取出于4℃存放的磁珠并涡旋振荡使磁珠彻底悬浮，然后取30 μL磁珠置于1.5 mL无菌无酶的离心管中，向其中加入200 μL Wash/Binding Buffer，并涡旋以悬浮磁珠，置于磁力架上静置2 min，去上清，重复三次；接着向洗涤后的磁珠中加入520 μL生物素标记的CCL25b启动子片段(按照磁珠结合核苷酸标准的1.5倍原则加入)，涡旋以悬浮磁珠，4℃过夜，然后将磁珠与启动子片段的复合物置于磁力架上静置2 min，去上清；向所得沉淀中加入500 μL Wash/Binding Buffer，涡旋以悬浮磁珠，置于磁力架上静置2 min，去上清，重复三次；向上述所得沉淀中加入100 μL TE并用移液器轻轻吹吸混匀，得启动子–磁珠复合物。

 2.5. DNA pull down

根据2.3中所测得的红鳍东方鲀鳃、脑组织总蛋白的浓度，按照每30 μL磁珠加入500 μg组织总蛋白的标准，制备启动子–磁珠–蛋白复合物。首先将活性组织总蛋白从−80℃取出并置于冰盒内缓慢复温，取110 μL脑组织蛋白样品、170 μL鳃组织蛋白样品分别向其中加入2 μL蛋白酶抑制剂、2 μL DTT，混匀后加入到过夜孵育后的启动子–磁珠复合物中并置于4℃孵育5 h。然后将孵育后的复合物置于磁力架上静置2 min，去除上清液，收集磁珠。用冰冷PBS (500 μL)洗涤上述收集到的磁珠，重复三次，尽可能去除上清，收集沉淀，得到启动子–磁珠–蛋白复合物。向上述所得复合物中加72 μL PBS悬浮，取出15 μL用于SDS-PAGE垂直电泳检测，剩余57 μL置于磁力架上加磁力2分钟，弃上清，沉淀置于−80℃保存用于质谱鉴定。

 2.6. 银染

SDS-PAGE垂直电泳完毕后，我们使用上海生工的低背景银染试剂盒(产品编号：C510027)对凝胶进行染色，实验步骤参照试剂盒所提供方法，染色完毕后进行拍照。

 2.7. 质谱检测

为了分析DNA pull down得到的CCL25b启动子结合蛋白的种类，我们将步骤2.5中得到的启动子–磁珠–蛋白复合物送到上海拜谱生物科技有限公司进行质谱分析(QE鉴定)。质谱测试数据用MaxQuant1.6.1.0软件检索Uniprot Protein Database数据库。基于强度定量法(Intensity based absolute quantification, iBAQ)对鉴定的蛋白质进行定量 [ 9 ]，其基本原理为每个蛋白质鉴定到的全部肽段曲线下的面积之和(AUCs)与此蛋白的理论酶切肽段数(N)之比为此蛋白的表达量(AUCs/N)。

 2.8. GO富集分析

将质谱结果分析后，通过R语言包clusterProfiler v3.18.1 [ 10 ] 对鉴定得到的蛋白进行GO富集分析，以此确定质谱检测到的蛋白质行使的主要生物学功能。其中adjusted P-values < 0.05的GO术语即为质谱检测到的蛋白质显著富集的GO term。

 2.9. 蛋白质相互作用分析

结合GO富集分析结果以及UniProt (https://www.uniprot.org/)和GeneCards (https://www.genecards.org/)网站对蛋白基本功能的注释，我们将富集到“核酸结合”和“核苷结合”术语上的关键蛋白导入到STRING v11.0数据库(https://string-db.org/)中，筛选可信度(combined score ≥ 0.15)较高的蛋白质互作网络(Protein-protein interaction network, PPI)，之后将数据导入到Cytoscape v3.7.1 (https://cytoscape.org/)进行可视化输出。

 3. 结果与分析 3.1. 生物素标记启动子片段的制备

使用外引物对通过PCR扩增技术、琼脂糖凝胶电泳、切胶纯化并回收，获得一次PCR产物(图2(A))。为保证所回收启动子片段的纯度及特异性，再以一次PCR产物为模板，使用内引物对进行降落PCR扩增技术、琼脂糖凝胶电泳、普通DNA产物纯化并回收，即获得目标启动子片段(图2(B))，图2表明目标启动子片段纯度较高，无杂带污染。测序结果同样显示启动子片段能够很好的比对到红鳍东方鲀基因组上。

图2. 生物素标记的启动子片段的制备

 3.2. DNA pull down

根据步骤2.5中的实验操作，将制备的启动子–磁珠复合物分别与脑、鳃组织总蛋白孵育，纯化后将特异结合的蛋白进行SDS-PAGE垂直电泳及银染，银染结果如图3所示。

图3. DNA pull down产物SDS-PAGE后银染

 3.3. 质谱结果分析与转录因子筛选

完成样品胰酶酶解等前处理、二维色谱上机分析以及单次数据检索分析，质谱结果显示在脑中共鉴定得到1705个蛋白质，在鳃中共鉴定得到2458个蛋白质。将这些鉴定得到的蛋白通过R语言包clusterProfiler v3.18.1进行GO富集分析，GO富集分析结果显示有56个编码生物学功能与核酸结合相关的差异性蛋白质的基因ID，有144个编码生物学功能与核苷结合相关的差异性蛋白质的基因ID (图4)。在UniProt和GeneCards网站依据蛋白的基本功能分别对上述200个差异性蛋白质的基因ID进行检索，结果显示富集到“DNA结合”这一术语上的蛋白包括RNA聚合酶、转录调控蛋白和其它结合蛋白，我们从中筛选出6个生物学功能与转录过程相关的蛋白质，其在脑和鳃中的iBAQ值如表4。

 3.4. 蛋白质相互作用分析

经STRING数据库及Cytoscape软件构建的可视化PPI网络如图所示(图5)。整个网络包含两种类型的互作：DNA pull down实验验证和来自文献的互作关系。主网络中共包含22种蛋白质，经实验验证得到的潜在转录因子有6个，包括PURA、ARHGAP35、NME2、RAP2C、C1QBP和DRG1。其中ARHGAP35 (9)的度最高。与上述转录因子以及靶基因CCL25b存在直接或间接相互作用的蛋白有15个。其中CDH1 (13)、RASA1 (10)和RHOA (10)的度相对较高。

图4. GO富集分析

Transcriptional regulators obtained by mass spectrometry identification (6
uniprot_id gene_id iBAQ_脑 iBAQ_鳃
A0A3B5KAS0 PURA 31,132,000 671,670
H2U1U6 ARHGAP35 99,725 0
H2SQ30 NME2 1,526,700 10,165,000
A0A674N6S9 RAP2C 5,216,600 0
A0A674PBX6 C1QBP 7,062,300 0
H2TJR7 DRG1 11,143,000 8,848,700

表4. 质谱鉴定获得的转录调控因子(6个)

图5. 蛋白质相互作用网络图

 4. 讨论

遗传信息传递的过程较为复杂，主要涉及染色质激活、转录起始、转录后修饰、转录产物在细胞内的转运、翻译起始、翻译后修饰等诸多步骤，而针对基因表达的调控可发生于上述的任一环节。转录作为基因组表达的第一步，是真核细胞所有生命活动的基础，参与细胞的生长和分裂、基因组结构和修复，与炎症和癌症等疾病发生发展也有密切关系，因而发生在转录水平的调节，尤其是转录起始水平的调节，对基因表达有着至关重要的作用 [ 4 ]。真核生物转录起始需要RNA聚合酶对起始点上游DNA序列进行识别和结合，生成转录前起始复合体，而这种识别和结合依靠于转录因子。转录因子是一种可以调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。

为了研究红鳍东方鲀CCL25b基因在细胞中的表达调控机制，本研究中，我们首次通过DNA pull down技术对结合在红鳍东方鲀CCL25b启动子区域的转录因子进行了富集。将组织活性总蛋白、5’末端被生物素标记的双链DNA启动子片段和带有链霉亲和素标记的磁珠共同孵育后，由于生物素与链霉亲和素的极高亲和力，复合物可被下拉 [ 11 ]。随后我们将下拉产物进行银染，观察到有特异性条带之后将下拉产物送质谱检测。将质谱鉴定得到的蛋白进行GO富集分析，富集分析结果表明有56个编码蛋白的基因富集到“translation regulator activity, nucleic acid binding”这一术语上，有144个编码蛋白的基因富集到“nucleoside binding”这一术语上。此外，富集结果分析表明许多经质谱鉴定到的基因还富集到了与翻译、酶结合、核糖体形成等相关的GO术语上，我们猜测造成这种现象的原因可能有以下两点：其一可能是由于在整个pull down过程中特别是在提取活性组织总蛋白时没有进行相应的RNaseA的处理，导致大量的mRNA会与启动子片段下游(能转录产生mRNA的部分)产生杂交，继而将与mRNA相结合的核糖体钓取出来。其二可能是由于本次实验中我们采用的蛋白是组织总蛋白，胞质中的蛋白可能会对实验结果产生一定的影响。

本实验中我们基于iBAQ对鉴定的蛋白质进行定量。根据蛋白质iBAQ值的高低以及在UniProt和NCBI等数据库中进行的文献调研和生物信息学分析结果，本文选择了DNA结合蛋白C1QBP、PURA、ARHGAP35、NME2、RAP2C、DRG1进行后续的分析。

研究表明基因PURA在人类中编码Pur-alpha蛋白 [ 12 ]，Pur-alpha是高等生物中发现的第一个序列特异性单链DNA结合蛋白 [ 12 ]。它与单链和双链DNA都有结合，在其结合部位的富含嘌呤的链上与G残基进行接触。Pur-alpha属于由四个成员组成的Pur蛋白家族，其中还包括Pur-beta (GenBank AY039216.1; GI:14906267) [ 12 ] 和两种形式Pur-gamma (变体A，GenBank AF195513.2；变体B，GenBank AY077841) [ 13 ]。从细菌到人类的Pur蛋白质序列都包含一个高度保守的氨基酸片段 [ 12 ] [ 14 ] (参见NCBI smart00712)。人类的Pur-alpha包含这个Pur结构域的三个重复，细菌的Pur-alpha只包含一个 [ 12 ] [ 15 ]。这种进化上的保守性意味着这个结构域的特定序列对整个生物体光谱中的大多数物种的生存都很重要。由于Pur-alpha在低等生物和人类中的功能差别很大，因此Pur结构域的这种基本性质引起了人们的关注。研究表明Pur-alpha对哺乳动物的大脑和血细胞发育至关重要 [ 16 ]，在我们的研究中也发现转录因子PURA在红鳍东方鲀脑中的iBAQ值要远远高于鳃中的，这与之前的研究结果保持一致。在人类中，Pur-alpha的功能是激活细胞核中的转录，促进细胞质中的RNA运输，并在细胞周期中调节DNA复制 [ 14 ]。在某些功能中，Pur-alpha与家族成员Pur-beta相互作用 [ 17 ] [ 18 ]。一些细胞周期调控功能可能是通过Pur-alpha与Cyclin/Cdk蛋白激酶的结合来实现的，Cyclin/Cdk蛋白激酶对调节细胞周期转换点的蛋白质进行磷酸化 [ 19 ] [ 20 ]。所有生物体对Pur-alpha的要求都是通过Pur-alpha与核酸结合的能力以及与调节和运输蛋白的相互作用来实现的。

ARHGAP35，也称为GRLF1，其在人体中编码糖皮质激素受体的DNA结合因子1。研究表明人糖皮质激素受体DNA结合因子与糖皮质激素受体基因(hGR基因)的启动子区相关联，是糖皮质激素受体转录的阻遏物。此外，生物化学分析表明，ARHGAP35的相互作用具有序列特异性，ARHGAP35的转录功效是通过其与特定序列基序的相互作用来调节的，其表达水平受糖皮质激素调节。研究发现糖皮质激素是大脑正常发育所必需的，它启动终端成熟，重塑轴突和树突，并影响细胞的生存 [ 21 ]，也可能在海马发育中发挥作用。这与我们的研究结果保持一致，我们的质谱鉴定数据表明在红鳍东方鲀的脑中鉴定到了ARHGAP35，而在红鳍东方鲀的鳃中没有发现ARHGAP35。此外，糖皮质激素通过与糖皮质激素受体结合影响细胞，被激活的糖皮质激素受体–糖皮质激素复合物在细胞核中上调抗炎蛋白的表达(这一过程被称为转录激活)，并通过阻止其他转录因子从细胞核中转录到细胞内，抑制细胞内促炎蛋白的表达(转录抑制) [ 22 ]。糖皮质激素也被证明在T淋巴细胞的发育和稳态中起作用，这在T细胞系对糖皮质激素的敏感性增加或降低的转基因小鼠中得到了证明 [ 23 ]。有趣的是，目标基因CCL25也被认为在T 细胞的发育中发挥作用 [ 1 ]。鉴于功能上的相关性，我们推测ARHGAP35很有可能作为CCL25的转录因子而发挥作用。

研究表明NME2作为MYC基因的转录激活剂，能够非特异性结合DNA [ 24 ] [ 25 ]。与MYC基因启动子的核酸酶超敏元件(NHE) III (1)区域内的单链鸟嘌呤和富胞苷链结合而不与双链NHE III (1)结合 [ 25 ]。而Myc蛋白作为转录因子，又可以通过结合增强子盒序列(E-boxes)和招募组蛋白乙酰转移酶(HATs)来激活许多促增殖基因的表达。研究表明Myc的功能是通过招募转录延伸因子来调控活跃转录基因的转录延伸 [ 26 ]。它也可以作为转录抑制因子，通过结合Miz-1转录因子并置换p300共同激活因子，抑制Miz-1目标基因的表达。此外，myc在控制DNA复制方面有直接作用 [ 27 ]，这种活动可能有助于癌细胞的DNA扩增。

RAP2C基因编码的蛋白质是Ras GTPase超家族的Ras相关蛋白亚家族的成员。该家族的成员是小的GTP酶，它们充当分子开关来调节细胞增殖、分化和凋亡。据报道，该蛋白质可激活血清反应元件的体外转录活性。可能在SRE介导的基因转录中起作用 [ 28 ]。研究表明基因C1QBP可能参与调节FOXC1转录活性和NFY/CCAAT结合因子复合物介导的转录 [ 29 ] [ 30 ]。有趣的是，我们的质谱数据显示RAP2C蛋白和C1QBP蛋白只在红鳍东方鲀的的脑组织中鉴定到，这可能与转录因子的组织特异性相关。

Drg1是一种人类GTPase，属于Obg家族，在古生菌和真核生物中发现，但在真细菌中未发现 [ 31 ] [ 32 ]。DRG1通过水解GTP中的γ-磷酸键，催化GTP向GDP的转化，具有内在的GTP酶活性 [ 33 ] [ 34 ]。我们猜测这可能与转录因子的活性相关。

尽管转录领域的研究在过去的半个世纪里取得了重大的进展，但理解转录的机制和调控对生命科学来说仍然是一个巨大的挑战，具有核心的重要性。本实验的质谱鉴定获得了多个候选的DNA结合蛋白，其中不乏非特异结合蛋白。虽然这些蛋白在调控CCL25b基因表达中的实际功能尚不清楚，但我们为寻找CCL25b的DNA相互作用蛋白提供了新的思路。这些初步结果将有助于我们进一步了解与CCL25b表达调控机制相关的潜在生物学过程。

 基金项目

国家重点研发计划资助(编号：2018YFD0900301-10)。

 文章引用

尚凤芹,李 岩,陆 芸,王秀利,刘 洋. 红鳍东方鲀结合CCL25b核心启动子区转录因子的鉴定 Identification of Transcription Factors Binding the Core Promoter Region of CCL25b in Takifugu rubripes[J]. 海洋科学前沿, 2021, 08(04): 69-81. https://doi.org/10.12677/AMS.2021.84008

 参考文献 References Vicari, A.P., Figueroa, D.J., Hedrick, J.A., Foster, J.S., Singh, K.P., Menon, S., Copeland, N.G., Gilbert, D.J., Jenkins, N.A. and Ba Con, K.B. (1997) TECK: A Novel CC Chemokine Specifically Expressed by Thymic Dendritic Cells and Potentially Involved in T Cell Development. Immunity, 7, 291-301.
https://doi.org/10.1016/S1074-7613(00)80531-2 Ringe, J., Hemmati-Sadeghi, S., Fröhlich, K., Engels, A. and Sittinger, M. (2019) CCL25-Supplemented Hyaluronic Acid Attenuates Cartilage Degeneration in a Guinea Pig Model of Knee Osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research, 37, 1723-1729.
https://doi.org/10.1002/jor.24312 Xu, B.P., Deng, C., Wu, X., Ji, T., Zhao, L., Han, Y.H., Yang, W.W., Qi, Y.T., Wang, Z., Yang, Z., et al. (2020) CCR9 and CCL25: A Review of Their Roles in Tumor Promotion. Journal of Cellular Physiology, 235, 9121-9132.
https://doi.org/10.1002/jcp.29782 Cramer, P. (2019) Eukaryotic Transcription Turns 50. Cell, 179, 808-812.
https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.09.018 Nagore, L.I., Nadeau, R.J., Guo, Q., Jadhav, Y.L.A., Jarrett, H.W. and Haskins, W.E. (2013) Purification and Characterization of Transcription Factors. Mass Spectrometry Reviews, 32, 386-398.
https://doi.org/10.1002/mas.21369 Ishihama, A. (2000) Functional Modulation of Escherichia Coli RNA Polymerase. Annual Review of Microbiology, 54, 499-518.
https://doi.org/10.1146/annurev.micro.54.1.499 Deng, W.G., Ying, Z., Montero, A. and Wu, K.K. (2003) Quantitative Analysis of Binding of Transcription Factor Complex to Biotinylated DNA Probe by a Streptavidin-Agarose Pulldown Assay. Analytical Biochemistry, 323, 12-18.
https://doi.org/10.1016/j.ab.2003.08.007 Tran, D.H., Shishido, Y., Chung, S.P., Trinh, H., Yorita, K., Sakai, T. and Fukui, K. (2015) Identification of DNA-Binding Proteins That Interact with the 5’-Flanking Region of the Human D-Amino Acid Oxidase Gene by Pull-Down Assay Coupled with Two-Dimensional Gel Electrophoresis and Mass Spectrometry. Journal of Pharmaceutical Biomedical Analysis, 116, 94-100.
https://doi.org/10.1016/j.jpba.2015.02.031 Schwanhusser, B., Busse, D., Li, N., Dittmar, G., Schuchhardt, J., Wolf, J., Chen, W. and Selbach, M. (2013) Global Quantification of Mammalian Gene Expression Control. Nature, 495, 126-127.
https://doi.org/10.1038/nature11848 Yu, G., Wang, L.G., Han, Y. and He, Q.Y. (2012) clusterPro-filer: An R Package for Comparing Biological Themes among Gene clusters. Omics—A Journal of Integrative Biology, 16, 284-287.
https://doi.org/10.1089/omi.2011.0118 Wu, K.K. (2006) Analysis of Protein-DNA Binding by Streptavidin-Agarose Pulldown. Methods in Molecular Biology, 338, 281-290.
https://doi.org/10.1385/1-59745-097-9:281 Bergemann, A.D., Ma, Z.W. and Johnson, E.M. (1992) Sequence of cDNA Comprising the Human Pur Gene and Sequence-Specific Single-Stranded-DNA-Binding Properties of the En-coded Protein. Molecular Cellular Biology, 12, 5673-5682.
https://doi.org/10.1128/MCB.12.12.5673 Hong, L. and Johnson, E.M. (2002) Distinct Proteins Encoded by Alternative Transcripts of the PURG Gene, Located Contrapodal to WRN on Chromosome 8, Determined by Differential Termination/Polyadenylation. Nucleic Acids Research, 30, 2417-2426.
https://doi.org/10.1093/nar/30.11.2417 Johnson, E.M. (2003) The Pur Protein Family: Clues to Function from Recent Studies on Cancer and AIDS. Anticancer Research, 23, 2093-2100. Almut, G., Stéphane, R., Dirk, K., Johannes, S., Dierk, N. and James, H.N. (2010) Of Bits and Bugs—On the Use of Bioinformatics and a Bacte-rial Crystal Structure to Solve a Eukaryotic Repeat-Protein Structure. PLoS ONE, 5, e13402.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0013402 Khalili, K., et al. (2003) Pur Is Essential for Postnatal Brain De-velopment and Developmentally Coupled Cellular Proliferation as Revealed by Genetic Inactivation in the Mouse. Molec-ular Cellular Biology, 23, 6857-6875.
https://doi.org/10.1128/MCB.23.19.6857-6875.2003 Hariharan, S., Kelm, R.J. and Strauch, A.R. (2014) The Purα/Purβ Single-Strand DNA-Binding Proteins Attenuate Smooth-Muscle Actin Gene Transactivation in Myofibro-blasts. Journal of Cellular Physiology, 229, 1256-1271.
https://doi.org/10.1002/jcp.24564 Kelm, R.J., Elder, P.K., Strauch, A.R. and Getz, M.J. (1997) Sequence of cDNAs Encoding Components of Vascular Actin Single-Stranded DNA-Binding Factor 2 Establish Identity to Puralpha and Purbeta. The Journal of Biological Chemistry, 272, 26727-26733.
https://doi.org/10.1074/jbc.272.42.26727 Barr, S.M. and Johnson, E.M. (2001) Ras-Induced Colony For-mation and Anchorage-Independent Growth Inhibited by Elevated Expression of Puralpha in NIH3T3 Cells. Journal of Cellular Biochemistry, 81, 621-638.
https://doi.org/10.1002/jcb.1099 Liu, H., Barr, S.M., Chu, C., Kohtz, D.S., Kinoshita, Y. and Johnson, E.M. (2005) Functional Interaction of Purα with the Cdk2 Moiety of Cyclin A/Cdk2. Biochemical Biophysical Research Communications, 328, 851-857.
https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2005.01.038 Lupien, S.J., Mcewen, B.S., Gunnar, M.R. and Heim, C. (2009) Effects of Stress throughout the Lifespan on the Brain, Behaviour and Cognition. Nature Reviews Neuroscience, 10, 434-445.
https://doi.org/10.1038/nrn2639 Rhen, T. and Cidlowski, J.A. (2005) Antiinflammatory Action of Glucocorticoids—New Mechanisms for Old Drugs. The New England Journal of Medicine, 353, 1711-1723.
https://doi.org/10.1056/NEJMra050541 Pazirandeh1, A., Xue, Y., Prestegaard, T., Jondal, M. and Okret, S. (2002) Effects of Altered Glucocorticoid Sensitivity in the T Cell Lineage on Thymocyte and T Cell Homeostasis. The FASEB Journal, 16, 727-729.
https://doi.org/10.1096/fj.01-0891fje Postel, E., Berberich, S., Flint, S. and Ferrone, C. (1993) Human c-myc Transcription Factor PuF Identified as nm23-H2 Nucleoside Diphosphate Kinase, a Candidate Suppressor of Tumor Me-tastasis. Science, 261, 478-480.
https://doi.org/10.1126/science.8392752 Dexheimer, T.S., Carey, S.S., Zuohe, S., Gokhale, V.M., Hu, X., Murata, L.B., Maes, E.M., Weichsel, A., Sun, D. and Meuillet, E.J. (2009) NM23-H2 May Play an Indirect Role in Transcriptional Activation of c-myc Gene Expression But Does Not Cleave the Nuclease Hypersensitive Element III1. Molecular Cancer Therapeutics, 8, 1363-1377.
https://doi.org/10.1158/1535-7163.MCT-08-1093 Rahl, P.B. and Young, R.A. (2014) MYC and Transcrip-tion Elongation. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine, 4, a020990.
https://doi.org/10.1101/cshperspect.a020990 Dominguez-Sola, D., Ying, C.Y., Grandori, C., Ruggiero, L., Chen, B., Li, M., Galloway, D.A., Gu, W., Gautier, J. and Dalla-Favera, R. (2007) Non-Transcriptional Control of DNA Replication by c-Myc. Nature, 448, 445-451.
https://doi.org/10.1038/nature05953 Guo, Z., Yuan, J., Tang, W., Chen, X., Gu, X., Luo, K., Wang, Y. and Yu, W.L. (2007) Cloning and Characterization of the Human Gene RAP2C, a Novel Member of Ras Family, Which Ac-tivates Transcriptional Activities of SRE. Molecular Biology Reports, 34, 137-144.
https://doi.org/10.1007/s11033-006-9023-9 Chandrani, C., David, H., Ryuji, K. and Maity, S.N. (2004) Hu-man p32, Interacts with B Subunit of the CCAAT-Binding Factor, CBF/NF-Y, and Inhibits CBF-Mediated Transcription Activation in Vitro. Nucleic Acids Research, 32, 3632-3641.
https://doi.org/10.1093/nar/gkh692 Huang, L.J., Chi, J., Berry, F., Footz, T.K., Sharp, M.W. and Walter, M.A. (2008) Human p32 Is a Novel FOXC1-Interacting Protein That Regulates FOXC1 Transcriptional Activity in Ocular Cells. Investigative Ophthalmology Visual Science, 49, 5243-5249.
https://doi.org/10.1167/iovs.07-1625 Li, B. and Trueb, B. (2000) DRG Represents a Family of Two Closely Related GTP-Binding Proteins. Biochim Biophys Acta, 1491, 196-204.
https://doi.org/10.1016/S0167-4781(00)00025-7 Leipe, D.D., Wolf, Y.I., Koonin, E.V. and Aravind, L. (2002) Classification and Evolution of P-Loop GTPases and Related ATPases. Journal of Molecular Biology, 317, 41-72.
https://doi.org/10.1006/jmbi.2001.5378 Markolovic, S., Zhuang, Q., Wilkins, S.E., Eaton, C.D., Ab-boud, M.I., Katz, M.J., McNeil, H.E., Lesniak, R.K., Hall, C., Struwe, W.B., et al. (2018) The Jumonji-C Oxygenase JMJD7 Catalyzes (3S)-lysyl Hydroxylation of TRAFAC GTPases. Nature Chemical Biology, 14, 688-695.
https://doi.org/10.1038/s41589-018-0071-y Perez-Arellano, I., Spinola-Amilibia, M. and Bravo, J. (2013) Human Drg1 Is a Potassium-Dependent GTPase Enhanced by Lerepo4. FEBS Journal, 280, 3647-3657.
https://doi.org/10.1111/febs.12356
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