BR Botanical Research 2168-5665 Scientific Research Publishing 10.12677/BR.2020.96066 BR-38565 BR20200600000_51317763.pdf 生命科学 沙田柚自交不亲和花柱数字基因表达谱及相关基因分析 Digital Gene Expression Profiling Analysis of Self-Incompatibility Styles in Citrus grandis var. Shatinyu 张 渝 2 1 李 惠敏 2 1 刘 玉洁 2 1 郭 丹妮 2 1 刘 华英 2 1 秦 新民 2 * 广西师范大学生命科学学院，广西 桂林 null 14 10 2020 09 06 536 544 © Copyright 2014 by authors and Scientific Research Publishing Inc. 2014 This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

为探索沙田柚自交不亲和的分子机理，以沙田柚自交与异交1~3天的花柱为材料，利用数字基因表达谱技术对样品cDNA文库进行差异基因表达谱分析。结果表明：异交1 d/自交1 d花柱中，上调表达的基因有244个，下调表达的基因有27个；异交2 d/自交2 d花柱中，上调表达基因有265个，下调表达基因有244个；异交3 d/自交3 d花柱，上调表达的基因有193个，下调表达的基因有685个。在SY1/SZ1、SY2/SZ2和SY3/SZ3中共有的差异表达的基因为30个。差异表达基因的GO功能显著性富集分析结果表明，这些差异表达的基因主要参与应对各种化学物质、植物激素、内源和外源物质的刺激及信号转导过程。通过本研究，挖掘出了一些与沙田柚自交不亲和相关的基因，可为今后阐明沙田柚配子体自交不亲和的分子机理提供依据。 This study aimed to understand the self-incompatibility mechanism in Citrus grandis var. Sha-tinyu. The one day, two days and three days styles of Shatinyu after self-pollination and cross- pollination were used to construct DNA libraries and the gene expression profiles were analyzed by Solexa sequencing technology. The results of solexa sequencing showed that a total of 271 different expression genes (DEGs) were obtained from the 1 d self-and cross-pollinated styles, in which 244 up-regulated expression and 27 down-regulated expression. 265 up-regulated ex-pressed genes and 244 down-regulated expressed genes were in 2 d self-and cross-pollinated styles, 193 up-regulated expressed genes and 685 down-regulated expressed genes in compar-ing 3 d self-and cross-pollinated styles. Moreover, statistics of differentially expressed genes showed that there were 30 differentially expressed genes coexisted in SY1/SZ1, SY2/SZ2 and SY3/SZ3. Gene Ontology analysis showed that the DEGs were mainly involved in responding to all kinds of chemicals, plant hormones, the stimulation of endogenous and exogenous sub-stances and signal transduction process. In sum, through this study some genes associated with self-incompatibility in Shatianyu were discovered. These results will provide a theoretical ref-erence for further exploration of self-incompatibility molecular mechanism in Citrus grandis var. Shatinyu.

 沙田柚，配子体自交不亲和，花柱，差异表达基因，数字基因表达谱, Citrus grandis var. Shatinyu Hort Gametophytic Self-Incompatibility Styles Differentially Expressed Genes Digital Gene Expression Profile 摘要

为探索沙田柚自交不亲和的分子机理，以沙田柚自交与异交1~3天的花柱为材料，利用数字基因表达谱技术对样品cDNA文库进行差异基因表达谱分析。结果表明：异交1 d/自交1 d花柱中，上调表达的基因有244个，下调表达的基因有27个；异交2 d/自交2 d花柱中，上调表达基因有265个，下调表达基因有244个；异交3 d/自交3 d花柱，上调表达的基因有193个，下调表达的基因有685个。在SY1/SZ1、SY2/SZ2和SY3/SZ3中共有的差异表达的基因为30个。差异表达基因的GO功能显著性富集分析结果表明，这些差异表达的基因主要参与应对各种化学物质、植物激素、内源和外源物质的刺激及信号转导过程。通过本研究，挖掘出了一些与沙田柚自交不亲和相关的基因，可为今后阐明沙田柚配子体自交不亲和的分子机理提供依据。

 关键词

沙田柚，配子体自交不亲和，花柱，差异表达基因，数字基因表达谱

 Digital Gene Expression Profiling Analysis of Self-Incompatibility Styles in Citrus grandis var. Shatinyu<sup> </sup>

Yu Zhang, Huimin Li, Yujie Liu, Danni Guo, Huaying Liu, Xinmin Qin*

College of Life Science, Guangxi Normal University, Guilin Guangxi

Received: Oct. 13th, 2020; accepted: Nov. 5th, 2020; published: Nov. 12th, 2020

 ABSTRACT

This study aimed to understand the self-incompatibility mechanism in Citrus grandis var. Shatinyu. The one day, two days and three days styles of Shatinyu after self-pollination and cross- pollination were used to construct DNA libraries and the gene expression profiles were analyzed by Solexa sequencing technology. The results of solexa sequencing showed that a total of 271 different expression genes (DEGs) were obtained from the 1 d self-and cross-pollinated styles, in which 244 up-regulated expression and 27 down-regulated expression. 265 up-regulated expressed genes and 244 down-regulated expressed genes were in 2 d self-and cross-pollinated styles, 193 up-regulated expressed genes and 685 down-regulated expressed genes in comparing 3 d self-and cross-pollinated styles. Moreover, statistics of differentially expressed genes showed that there were 30 differentially expressed genes coexisted in SY1/SZ1, SY2/SZ2 and SY3/SZ3. Gene Ontology analysis showed that the DEGs were mainly involved in responding to all kinds of chemicals, plant hormones, the stimulation of endogenous and exogenous substances and signal transduction process. In sum, through this study some genes associated with self-incompatibility in Shatianyu were discovered. These results will provide a theoretical reference for further exploration of self-incompatibility molecular mechanism in Citrus grandis var. Shatinyu.

Keywords:Citrus grandis var. Shatinyu Hort, Gametophytic Self-Incompatibility, Styles, Differentially Expressed Genes, Digital Gene Expression Profile

Copyright © 2020 by author(s) and beplay安卓登录

This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0).

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 1. 引言

植物自交不亲和性(Self-incompatibility, SI)对于避免近亲繁殖有很重要的作用 [ 1 ] [ 2 ]，其研究在植物生殖学和杂交优势利用等方面具有重要的理论和应用价值。

目前植物自交不亲和的研究主要集中在十字花科、茄科、蔷薇科、玄参科和罂粟科植物。沙田柚为芸香科、柑橘属植物，其自交不亲和的研究在细胞学、蛋白质化学等方面取得了一定进展 [ 3 ] - [ 9 ]，但有关沙田柚配子体自交不亲和相关基因表达和鉴定方面的研究尚未见报道。

数字基因表达谱技术以高通量测序为基础，可用于检测特定细胞或组织在特定状态下不同样品中的差异表达基因的种类和丰度信息 [ 10 ]，因而，近年来已被广泛应用于许多领域的研究中 [ 11 ] [ 12 ] [ 13 ]。

本研究以沙田柚自花授粉和异花授粉1 d、2 d、3 d后的花柱为实验材料，分别构建测序文库，进行了数字基因表达谱测序，试图挖掘与自交不亲和反应相关的差异表达的基因，进而为研究沙田柚配子体自交不亲和性机理提供分子依据。

 2. 材料与方法 2.1. 材料处理与收集

实验材料为沙田柚(Citrus grandis var. Shatianyu Hort)花柱。在沙田柚的盛花期分别对沙田柚样树进行人工自花授粉(沙田柚 × 沙田柚)和异花授粉(酸柚 × 沙田柚)，然后分别采集自交1~3d (标记为SZ1、SZ2、SZ3)和异交授粉1~3d (标记为SY1、SY2、SY3)后的花柱，立即放入液氮，保存于−80℃超低温冰箱中备用。

 2.2. 总RNA的提取及文库构建

总RNA的提取采用TRIzol 试剂盒(Invitrogen 公司)并参照其操作手册进行。建库与测序由华大科技有限公司进行。

 2.3. 测序数据分析及差异表达基因的筛选

测序数据采用RPM和RPKM [ 14 ] 值进行标准化处理。异交1d/自交1d、异交2d/自交2d和异交3d/自交3d花柱组合之间的差异表达基因采用DESeq方法 [ 15 ] 进行确定。差异基因筛选条件为qvalue < 0.005且log2 (fold change) > 1。

 2.4. 差异基因基因功能注释和KEGG 代谢通路分析

沙田柚自交和异交授粉花柱差异表达基因进行GO功能富集显著性分析与KEGG代谢通路富集性分析分别采用采用GO数据库(http://www.Geneontology.org/)和KOBAS (2.0)软件进行。

 2.5. 荧光定量RT-PCR检测

为检测测序结果的可靠程度，随机挑选6个基因进行RT-PCR测定。内参基因为GAPDH (表1)。荧光定量PCR的反应体系和程序参见Fermentas公司的SYBR Green master mix说明书，引物的退火温度为56℃~60℃，采用2−ΔΔCt法对表达量进行分析计算，实验设置3次重复。

The primers of genes analysed by qPC
基因序列号 基因名称 正向引物(5’-3’) 反向引物(5’-3’)
Unigene6484_All GAPDH ACTGTGGAAGCGAGCAGAAT ACTTCGGTGACTGCATCCTT
Unigene34907_All SLA ACGTTAACAGCGATGGCATC CTGATTCCGATCGCTTTGAG
Unigene2441_All SRA GCCTAATTACAACGACGGCT GGCCAGTTCTTTAGCATGCT
Unigene35613_All EBA GCCAAAACTGACAGCAGCAA TGCTGGCTGTTTCGATGATG
Unigene674_All RIH AGCTTTTAGTGGCGGTTGGA CCACGCACCAATGAAGCTTA
Unigene15891_All UBP TGTGACTGATTGGCCATTCG ATTCAACTCCGGCAAGACGA
Unigene21248_All CBP ACTGCACTTTGGACAGAGCT TATGACGCTTTTTGGAGGTC

表1. 差异表达基因qRT-PCR验证引物信息

 3. 结果 3.1. 测序数据评估

文库测序得到的获得的Raw Data经处理分别得到Clean Reads，用比对软件SOAPaligner/SOAP2 [ 16 ] 将Clean Reads与参考基因组(甜橙)进行比对。结果表明SY1、SY2、SY3、SZ1、SZ2和SZ3获得的clean reads分别为11528402、11334516、11286963、11414971、11329671、11352636，6个样本中clean reads所占的比例在92.69%~95.07%。

 3.2. 差异表达基因分析的GO分类与富集分析 3.2.1. 差异基因的筛选

以qvalue < 0.005 且log2 (fold change) > 1为标准对SY1/SZ1、SY2/SZ2、SY3/SZ3三个组合之间的差异基因进行筛选。结果表明SY1/SZ1中，差异表达基因总数为271 (上调表的基因244个，下调表达的基因27个)。SY2/SZ2的差异表达基因为509 (上调表达基因265个，下调表达基因244个)。SY3/SZ3的差异表达基因为878，其中上调表达基因193个，下调表达基因为685个(图1)。

图1. 沙田柚自花授粉与异花授粉花柱差异表达基因的统计

 3.2.2. 差异表达基因的GO功能显著性富集分析

在SY1/SZ1中，生物过程、细胞组分和分子功能三个功能富集分析的基因数分别为741个，425个，198个。其中，生物过程的741个基因分为19个功能基因群；细胞组分中的425个基因分为12个功能基因群；分子功能中的198个基因分为8个功能基因群。SY2/SZ2中生物过程、细胞组分、分子功能三个功能富集分析的基因个数分别为1199个，797个，384个。其中，生物过程的1199个基因分为21个功能基因群；细胞组分中的797个基因分为13个功能基因群；而分子功能中的384个基因则分为12个功能基因群。SY3/SZ3比对中，生物过程、细胞组分和分子功能富集分析的基因个数分别为2227个，1389个，715个。其中，生物过程中的2227个基因可分为21个功能基因群；细胞组分中的1389个基因分为14个功能基因群；分子功能中的715个基因分为10个功能基因群。

 3.3. 差异表达基因的Pathway显著性富集分析

SY1/SZ1差异表达基因注释到146条KEGG代谢通路中(表2)。其中注释到淀粉和蔗糖代谢途径(ko00500)通路的基因数量最多，为10个(6.85%)，其次是戊糖和葡萄糖醛酸酯互变途径(ko00040)，以及聚糖降解(ko00511)途径，数量均为6 (4.11%)。

Differentially expressed genes enriched of KEGG pathways in SY1-VS-SZ
途径 差异基因注释 Qvalue Pathway ID
其他聚糖降解 6 (4.11%) 0.001404909 ko00511
糖和葡萄糖醛酸酯互变现象 6 (4.11%) 0.019126583 ko00040
淀粉和蔗糖代谢 10 (6.85%) 0.019696451 ko00500

表2. SY1/SZ1差异表达基因Pathway显著性富集统计

SY2/SZ2差异表达基因注释到251个KEGG代谢通路中(表3)。其中注释代谢途径(ko01100)通路的基因数量最多，为73个(29.08%)，其次为次生代谢产物的生物合成途径(ko01110)和植物激素信号转导途径(ko04075)，基因数量分别为44个(17.53%)和26个 (10.36%)。

Differentially expressed genes enriched of KEGG pathways in SY2-VS-SZ
途径 差异基因注释 Qvalue Pathway ID
淀粉和蔗糖代谢 18 (7.17%) 0.0003874210 ko00500
戊糖和葡萄糖醛酸酯互变现象 10 (3.98%) 0.0004252822 ko00040
苯丙素的生物合成 14 (5.58%) 0.0004252822 ko00940
次生代谢产物的生物合成 44 (17.53%) 0.0074408390 ko01110
氨基糖和核苷酸糖代谢 9 (3.59%) 0.0074408390 ko00520
苯丙氨酸代谢 7 (2.79%) 0.0074408390 ko00360
氰基氨基酸代谢 7 (2.79%) 0.0117669696 ko00460
醚脂类代谢 10 (3.98%) 0.0129689933 ko00565
植物激素信号转导 26 (10.36%) 0.0129689933 ko04075
代谢途径 73 (29.08%) 0.0196072044 ko01100
丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢 5 (1.99%) 0.0204112822 ko00250
黄酮和黄酮醇生物合成 6 (2.39%) 0.0219457980 ko00944
α-亚麻酸代谢 5 (1.99%) 0.0432683354 ko00592
异喹啉生物碱生物合成 3 (1.2%) 0.0481040160 ko00950

表3. SY2/SZ2差异表达基因Pathway显著性富集统计

SY3/SZ3差异表达基因注释到KEGG代谢通路为481条(表4)。与SY2/SZ2相同，注释到代谢途径(ko01100)通路的基因数量最多，为157 (32.64%)，其次为次生代谢产物的生物合成途径(ko01110)和植物激素信号转导途径(ko04075)，基因数量分别为118 (24.53%)和47 (9.77%)。

Differentially expressed genes enriched of KEGG pathways in SY3-VS-SZ
途径 差异基因注释 Qvalue Pathway ID
次生代谢产物的生物合成 118 (24.53%) 3.111726e-17 ko01110
黄酮类生物合成 33 (6.86%) 7.801713e-15 ko00941
黄酮和黄酮醇生物合成 21 (4.37%) 1.799464e-11 ko00944
二苯乙烯类、二芳基庚烷类和姜辣素的生物合成 28 (5.82%) 1.799464e-11 ko00945
代谢途径 157 (32.64%) 8.988912e-08 ko01100
苯丙素的生物合成 26 (5.41%) 1.093121e-07 ko00940
柠檬烯、蒎烯降解 17 (3.53%) 2.702901e-06 ko00903
玉米素生物合成 14 (2.91%) 9.886923e-05 ko00908
泛醌和其他吡咯醌生物合成 11 (2.29%) 1.350563e-04 ko00130
其他聚糖降解 9 (1.87%) 7.671060e-04 ko00511
植物激素信号转导 47 (9.77%) 7.671060e-04 ko04075
氰基氨基酸代谢 10 (2.08%) 6.456259e-03 ko00460
醚脂类代谢 15 (3.12%) 7.769444e-03 ko00565
苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成 7 (1.46%) 9.855672e-03 ko00400
角质,亚角质和蜡生物合成 8 (1.66%) 9.855672e-03 ko00073
油菜素类固醇生物合成 4 (0.83%) 1.048609e-02 ko00905
戊糖和葡萄糖醛酸酯互变现象 10 (2.08%) 1.057777e-02 ko00040
淀粉和蔗糖代谢 20 (4.16%) 1.133609e-02 ko00500
花青素生物合成 2 (0.42%) 1.882419e-02 ko00942
苯丙氨酸代谢 8 (1.66%) 2.536549e-02 ko00360
α-亚麻酸代谢 7 (1.46%) 3.322518e-02 ko00592
半乳糖代谢 8 (1.66%) 3.731857e-02 ko00052
苯并嗪类生物合成 4 (0.83%) 3.792505e-02 ko00402
胞吞作用 18 (3.74%) 3.851186e-02 ko04144
倍半萜和三萜生物合成 4 (0.83%) 3.854513e-02 ko00909
类胡萝卜素生物合成 10 (2.08%) 3.935430e-02 ko00906
单萜生物合成 3 (0.62%) 4.441394e-02 ko00902
抗坏血酸和醛酸代谢 7 (1.46%) 4.441394e-02 ko00053

表4. SY3/SZ3差异表达基因Pathway显著性富集统计

 3.4. 自交与异交花柱共有的差异表达基因

在SY1/SZ1、SY2/SZ2、SY3/SZ3组合差异表达基因分别统计的基础上，对在SY1/SZ1、SY2/SZ2和SY3/SZ3均达到差异表达的基因进行挖掘，结果表明共有30个基因在自交花柱与异交花柱之间达到差异表达水平，其表达量(Reads Per Kilobase per Million，RPKM)及功能注释见表5。在30个差异表达基因中目前G0、KEGG、NR数据库中未有功能注释(包括注释为hypothetical protein、uncharacterized protein或predicted protein)的基因为11个，其中无注释的基因4个。

Differentially expressed genes coexisted in self- and cross-pollinated style
Gene ID SY1 Y2 SY3 SZ1 SZ2 SZ3 Function annotation
Unigene12309_All 0.00 0.20 0.41 1.13 2.78 2.18 hypothetical protein
Unigene15891_All 0.92 6.72 2.08 10.49 20.99 11.71 protein serine/threonine kinase activity
Unigene30969_All 1.74 22.25 8.33 19.71 59.16 33.84 alpha-L-fucosidase; hydrolase activit;
Unigene27111_All 0.54 2.63 0.89 5.02 10.11 5.15 Ribonuclease H
Unigene21493_All 5.62 58.07 14.88 51.21 117.95 60.43 alpha-galacturonidase; polygalacturonase
Unigene32078_All 8.85 79.77 33.15 68.58 202.73 110.23 —
Unigene37536_All 1.62 1.26 0.85 12.61 11.30 3.02 cation-transporting ATPase activity
Unigene9477_All 1.82 13.47 5.07 13.72 34.81 19.28 predicted protein
Unigene27143_All 0.67 4.39 1.25 4.62 11.00 5.99 Xyloglucan galactosyltransferase
Unigene24605_All 4.17 19.20 6.38 26.50 44.38 19.09 UDP-glucosyl transferase
Unigene2299_All 12.18 36.84 22.90 58.40 117.90 68.80 cell wall modification
Unigene1873_All 16.09 43.79 20.06 73.69 145.29 59.30 —
Unigene17404_All 16.53 14.05 4.87 3.72 35.95 17.25 predicted protein
Unigene13392_All 14.58 55.81 27.44 60.06 136.27 76.54 uncharacterized protein
Unigene34584_All 2.09 9.05 4.62 8.56 29.28 18.43 cetate beta-D-glucosyltransferase
Unigene31258_All 2.68 7.98 4.66 10.41 28.54 11.61 2-alkenal reductase activity
Unigene21006_All 11.72 38.32 23.09 45.11 108.25 67.45 —
Unigene24125_All 10.88 31.69 11.12 40.51 70.47 51.12 xyloglucosyl transferase；
Unigene5640_All 6.18 19.11 10.75 22.14 64.04 37.50 uncharacterized protein
Unigene9582_All 3.20 8.24 3.89 10.41 22.10 13.59 LOB domain-containing protein
Unigene20618_All 4.24 13.65 4.05 13.61 32.93 17.26 conserved hypothetical protein
Unigene23161_All 19.04 6.45 19.58 56.51 96.35 43.17 conserved hypothetical protein
Unigene676_All 2.05 3.48 0.90 5.44 7.07 3.72 ATP binding protein
Unigene17565_All 4.79 13.54 4.74 12.45 30.40 14.30 predicted protein
Unigene24843_All 7.00 18.23 6.05 17.19 37.90 18.21 hypothetical protein
Unigene5338_All 3.47 0.09 2.97 8.22 7.66 12.23 adiponectin receptor
Unigene15711_All 9.96 27.57 16.36 21.14 13.57 3.84 —
Unigene29154_All 6.21 20.08 7.53 0.00 0.00 1.75 hypothetical protein
Unigene10706_All 1.58 3.92 2.03 0.00 0.00 0.10 predicted protein
Unigene13515_All 42.37 96.34 47.84 13.03 14.04 16.98 DNA binding protein

表5. 自交与异交花柱之间差异表达基因

注：—示数据库中无任何注释。

 3.5. qRT-PCR分析

分别提取自交和异交1~3d花柱总RNA，反转录后进行定量PCR验证。结果表明6个差异表达基因(EBA、SRA、UBP、RIB、RIH和CBP)在自交和异交1~3d花柱的相对表达量与表达谱分析的变化趋势一致(图2)。

图2. 差异表达基因qPCR验证

 4. 讨论与结论

数字基因表达谱技术能快速检测植物在不同组织细胞、不同发育阶段以及在众多逆境环境胁迫下基因的表达差异，在功能基因组学方面正在发挥着越来越重要的作用 [ 17 ] [ 18 ] [ 19 ]。本实验采用数字基因表达谱技术对沙田柚自交和异交1~3 d花柱之间的差异基因进行了分析。差异基因的Go功能注释结果表明在自交1 d与异交1 d的花柱中，差异表达的基因主要参与花粉管的伸长和发育的调控和植物细胞壁的修饰。在自交2 d/异交2 d的花柱和自交3 d/异交3 d的花柱，差异表达的基因主要参与应对化学物质、植物激素、内源和外源物质的刺激，信号转导。因此，沙田柚配子体自交不亲和反应是一个多基因协同作用的复杂过程。

KEEG显著性富集分析发现SY1-VS-SZ1、SY2-VS-SZ2、SY3-VS-SZ3三组差异表达基因的共有的通路为淀粉和蔗糖的代谢(ko00500)和戊糖和葡糖糖醛酸之间的互变(ko00040)。SY2-VS-SZ2和SY3-VS-SZ3所共有的显著性富集通路为木质素的生物合成(ko00940)，苯丙氨酸代谢(ko00360)，氰氨酸的代谢(ko00460)，醚酯的代谢(ko00565)，植物激素的信号转导(ko04075)、新陈代谢途径(ko01100)、黄酮和黄酮醇的生物合成(ko00944)、α-亚麻酸代谢(ko00592)。

自交与异交花柱共有的差异表达基因为30个，目前有注释的仅为15个，功能涉及到丝氨酸/苏氨酸激酶活性、α-岩藻糖苷酶、核糖核酸酶H、半乳糖醛酸酶、ATP结合蛋白(酶)、木葡聚糖半乳糖基转移酶、UDP-葡萄糖苷转移酶、乙酰乙基葡萄糖基转移酶、DNA结合蛋白，以及细胞壁修饰等，但其在沙田柚自交不亲和中的生理功能尚不明确。此外，15个差异表达基因目前数据库中尚无功能注释，其在沙田柚自交不亲和中的功能值得进一步深入研究。

 基金项目

国家自然科学基金(31360477)；广西教育厅项目(2013YB036)。

 文章引用

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