为了探索农杆菌介导的遗传转化中铁皮石斛对抗生素的耐性，本试验以铁皮石斛原球茎为原材料，在培养基中分别添加不同浓度潮霉素和卡那霉素进行培养，筛选出最适合铁皮石斛遗传转化的抗生素种类和浓度。研究表明：潮霉素浓度为40 mg/L时为临界浓度，接种一周后，植株出现黄化现象，2周后，出现死亡植株，培养17周后，铁皮石斛完全死亡。潮霉素浓度越大，铁皮石斛褐化和黄化速率增加，死亡速率越快，浓度低于40 mg/L，铁皮石斛则拥有一定的存活率，为15%左右。当卡那霉素浓度为600 mg/L，铁皮石斛的褐化和黄化现象出现在培养后第3周，培养17周后，浓度为200 mg/L、400 mg/L、600 mg/L卡那霉素，铁皮石斛原球茎死亡率依次为72%、68%、78%，之后仍保持一定的存活量。实验结果表明，铁皮石斛对潮霉素敏感性远大于卡那霉素，由此说明，铁皮石斛遗传转化中应选用潮霉素作为抗生素，而且使用浓度应在40 mg/L以上，卡那霉素不能用于铁皮石斛遗传转化。
For exploring the resistance of Dendrobium officinale to antibiotics in the process of agrobacte-rium-mediated genetic transformation, in this experiment, Protocorms of D. officinale, used as the raw material, were cultured on the medium which Hygroscopious and Kanamycin with different concentrations were added respectively to the basic medium for selecting the best antibiotics and its concentrations in genetic transformation of D. officinale. The results showed that Hygroscopious concentrations of 400 mg/L are as critical concentration in which plant became yellow after inoculated one week; a number of them died after two weeks and died totally after 17 weeks. The higher the concentration of Hygromycin is, the higher the rate of browning and yellowing is, and finally it can speed the higher mortality of D. officinale. When the Hygroscopious concentrations are below 400 mg/L, there is still small amount survival rate, 15%. When Kanamycin’s concentrations were 600 mg/L, the yellow and brown phenomenon presented after inoculated three weeks. When the concentration of Kygromycin was 200 mg/L, 400 mg/L, and 600 mg/L, the mortality was 72%, 68% and 78% after 17 weeks, respectively. After that, no death phenomenon appeared again. The experimental results show that D. officinale is more sensitive to hygromycin than to kanamycin. It is noted that Hygroscopious is subjected to be selected as antibiotics and its concentration should be above 40 mg/L, and Kanamycins cannot be used as antibiotics in genetic transformation of D. officinale.
刘玉红1，和凤美2，朱永平2，赵家清1*
1红河帮达实业有限公司，云南 红河
2云南农业大学，云南 昆明
收稿日期：2019年10月18日；录用日期：2019年11月14日；发布日期：2019年11月21日
为了探索农杆菌介导的遗传转化中铁皮石斛对抗生素的耐性，本试验以铁皮石斛原球茎为原材料，在培养基中分别添加不同浓度潮霉素和卡那霉素进行培养，筛选出最适合铁皮石斛遗传转化的抗生素种类和浓度。研究表明：潮霉素浓度为40 mg/L时为临界浓度，接种一周后，植株出现黄化现象，2周后，出现死亡植株，培养17周后，铁皮石斛完全死亡。潮霉素浓度越大，铁皮石斛褐化和黄化速率增加，死亡速率越快，浓度低于40 mg/L，铁皮石斛则拥有一定的存活率，为15%左右。当卡那霉素浓度为600 mg/L，铁皮石斛的褐化和黄化现象出现在培养后第3周，培养17周后，浓度为200 mg/L、400 mg/L、600 mg/L卡那霉素，铁皮石斛原球茎死亡率依次为72%、68%、78%，之后仍保持一定的存活量。实验结果表明，铁皮石斛对潮霉素敏感性远大于卡那霉素，由此说明，铁皮石斛遗传转化中应选用潮霉素作为抗生素，而且使用浓度应在40 mg/L以上，卡那霉素不能用于铁皮石斛遗传转化。
关键词 :铁皮石斛，潮霉素，卡那霉素，死亡率，原球茎
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铁皮石斛为兰科石斛属多年生草本植物，其生长受环境限制，繁殖周期长，存活率低，但最近几年来，兰科植物利用种子进行的组织培养已获得成功 [
不同物种对卡那霉素的抗性不一样，刘玉汇等 [
目前在兰花转基因研究中，研究者选用筛选剂的种类，浓度不尽相同，找到适宜的筛选剂和筛选浓度对于转基因试验的目的基因能否成功侵染具有重要意义。目前在兰科植物的转基因研究中，大多数研究者采用卡那霉素和潮霉素作筛选剂，但不同品种所使用的筛选剂和浓度也不尽相同。
为了探索农杆菌介导的遗传转化中抗生素对铁皮石斛的影响，本试验以铁皮石斛原球茎为原材料，在培养基中分别添加不同浓度潮霉素和卡那霉素进行实验，从中筛选出最适合铁皮石斛生长的抗生素种类和浓度。
云南农业大学园林园艺学院组织培养室利用种子组织培养获得的铁皮石斛原球茎。
培养室的光照强度为2000 lx，温度为(25 ± 2)℃，每天光照12 h。
培养基为MS + 0.56-BA + 6.8 g/LAgar + 30 g/L蔗糖，灭菌冷却至60℃左右时，在超净工作台上依次加入浓度梯度为5 mg/L、20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L、60 mg/L潮霉素和浓度梯度为50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L、600 mg/L卡那霉素，设置三个重复。选择同一生长水平且生长正常的铁皮石斛原球茎，每瓶接入60棵。见表1和表2。
| 编号Number | 浓度(mg/L) Concentration | 接种总数(颗) Number of incubation | 重复repeat |
|---|---|---|---|
| H0 | 0.00 | 60.00 | 3.00 |
| H1 | 5.00 | 60.00 | 3.00 |
| H2 | 20.00 | 60.00 | 3.00 |
| H3 | 30.00 | 60.00 | 3.00 |
| H4 | 40.00 | 60.00 | 3.00 |
| H5 | 50.00 | 60.00 | 3.00 |
| H6 | 60.00 | 60.00 | 3.00 |
表1. 潮霉素抗性浓度筛选
| 编号Number | 浓度(mg/L) Concentration | 接种总数(颗) Number of incubation | 重复repeat |
|---|---|---|---|
| K0 | 0.00 | 60.00 | 3.00 |
| K1 | 50.00 | 60.00 | 3.00 |
| K2 | 100.00 | 60.00 | 3.00 |
| K3 | 200.00 | 60.00 | 3.00 |
| K4 | 400.00 | 60.00 | 3.00 |
| K5 | 600.00 | 60.00 | 3.00 |
表2. 卡那霉素抗性浓度筛选表格
每周观察记录生长状况，记录死亡时间，死亡个数。计算每个浓度死亡速率，死亡率，最终死亡个数及平均死亡数。
死亡率为最终死亡总数与接种总数之比。
统计分析方法则采用DPS软件Duncan多重比较法，先求出各个处理的死亡率均值，同时进行处理间显著性差异分析。大写字母不同，表示有极显著差异，小写字母不同代表有显著差异，相同字母代表其对应处理没有显著差异。
对不同潮霉素B浓度下铁皮石斛原球茎死亡率随时间变化的跟踪统计，图1表明：随着培养时间的增加，铁皮石斛原球茎死亡速度表现出慢–快–平稳的规律。浓度越高，开始死亡时间越提前，最终死亡时间也提前，死亡速度加快。培养在60 mg/L浓度下的原球茎在84天后死亡率达100%，50 mg/L浓度下90天死亡达100%，40 mg/L浓度下稍微滞后，直到第98周时死亡率达100%，而20 mg/L、30 mg/L浓度下的原球茎没有完全死亡，死亡率达到85%后不再增加，既成活率保持在15%左右。
图1. 不同潮霉素浓度下铁皮石斛死亡率随培养时间的动态变化
由下表3可见，在设置的6个潮霉素B浓度梯度中，铁皮石斛原球茎死亡率随着潮霉素B浓度逐渐变大而升高。5 mg/L浓度下的原球茎成活率稳定保持在80%左右，而没有任何抗生素的情况下，成活率达95%以上。浓度0 mg/L与浓度5 mg/L的死亡率相对于其它几组极显著。由此说明，潮霉素浓度越低对铁皮石斛原球茎的死亡速度影响越小。临界浓度为30~40 mg/L，即今后在遗传转化时，潮霉素B浓度必须在临界浓度以上，才能筛选到阳性转基因植株。
| 浓度mg/L Concentration mg/L | 接种数 Inoculation number | 死亡数 Number of deaths | 死亡率% Mortality% |
|---|---|---|---|
| 0 | 60 | 7 | 11.67Aa |
| 5 | 60 | 15 | 25.00Aa |
| 20 | 60 | 50 | 93.33Aa |
| 30 | 60 | 56 | 96.67Aab |
| 40 | 60 | 60 | 100.00Ab |
| 50 | 60 | 60 | 100.00Bc |
| 60 | 60 | 60 | 100.00Bc |
表3. 不同浓度潮霉素对铁皮石斛死亡率影响
Note: Capital letter means significant at 1%. Small letter means significant at 5%. Different letters indicate significant differences between treatments. The same letters indicate same significant differences between treatments.
注：大写字母表示1%极显著水平，小写字母表示5%显著水平，不同的字母表示处理间差异显著，相同字母表示处理间差异不显著。
高浓度的潮霉素B对植物起到致死作用，低浓度的潮霉素会抑制植物生长。随着潮霉素浓度的增加，植物生长受到抑制程度就越大，当超过40 mg/L的浓度，培养时间达17周时，对铁皮石斛原球茎生长状态进行观察，发现原球茎失绿，变白色，几乎死亡，而对照组的铁皮石斛多数生长正常，逐渐分化成完整植株。5 mg/L浓度下生长受到一定抑制，有部分原球茎能分化形成较弱的小苗，另一部分依旧保持着原球茎的状态，且呈现出浅绿色，颜色不均匀，分化的真叶叶尖偏白。当浓度达到20 mg/L时，多数接种的原球茎死亡，剩余的无法分化出植株，一直保持着原球茎的状态且原球茎未见增大，浓度为30 mg/L的情况和20 mg/L相似，浓度为40 mg/L以上，植株白化，全部死亡，见表4、图2和图3。
| 不同潮霉素浓度(mg/L) Different hygromycin concentration | 生长情况 Growth | 死亡率% Mortality | 原球茎颜色 Protocorm color | 原球茎状态 Protocorm state |
|---|---|---|---|---|
| 0 | +++++ | 5Aa | 绿色 | 全部分化、正常生长 |
| 5 | ++++ | 25.00Bb | 浅绿，部分褐化 | 部分分化、缓慢生长 |
| 20 | +++ | 73.33Cc | 黄绿，部分褐化 | 部分分化、缓慢生长甚至停滞生长 |
| 30 | + | 96.67Dd | 黄绿，部分褐化 | 仅有少量分化、缓慢生长甚至停滞生长 |
| 40 | − | 100.00Dd | 白化 | 死亡 |
| 50 | − | 100.00Dd | 白化 | 死亡 |
| 60 | − | 100.00Dd | 白化 | 死亡 |
表4. 不同浓度潮霉素对铁皮石斛生长的影响(17周)
注：“−”代表死亡；“+”代表停滞生长，和接种时大小(5 mm)同等水平；“++”代表平均高度为5~10 mm，缓慢生长；“+++++”代表正常生长，平均高度10 mm以上。
图2. 潮霉素浓度为40 mg/L原球茎生长情况
图3. 潮霉素浓度为30 mg/L原球茎生长情况
图4. 卡那霉素不同浓度下铁皮石斛死亡率随筛选时间的变化
由图4可知，铁皮石斛对卡那霉素的敏感性较弱，培养至第三周才有极少量的植物材料死亡，随着培养时间的增加，死亡率有所增加，但增加速度平缓，之后保持平稳。没有加卡那霉素的对照，第8周前有少量死亡，死亡率达到10%左右，之后保持平稳，不再有死亡发生。当浓度在600 mg/L时，培养17周，死亡率最高，达78%，之后一直保持在78%。浓度在600 mg/L以下时，都有一定死亡率，在50 mg/L时，培养17周时，死亡率达45%，之后不再出现死亡。
由下表5可见，在设置的6个卡那霉素浓度梯度中，随着卡那霉素浓度增加，铁皮石斛死亡率不断升高。当浓度为600 mg/L、400 mg/L、200 mg/L，培养17周后，死亡率不显著，但与浓度100 mg/L、50 mg/L相比时，死亡率达极显著，不加卡那霉素的，死亡率最低。说明卡那霉素对铁皮石斛的生长有明显的抑制作用。卡那霉素对铁皮石斛生长没有临界值，由此可见，卡那霉素不能用于铁皮石斛遗传转化筛选。
| 浓度mg/L Concentration mg/L | 接种数 Inoculation number | 死亡数 Number of deaths | 死亡率% Mortality% |
|---|---|---|---|
| 600 | 60.00 | 47.00 | 78Aa |
| 400 | 60.00 | 41.00 | 74Aa |
| 200 | 60.00 | 43.00 | 72Aa |
| 100 | 60.00 | 27.00 | 48Bb |
| 50 | 60.00 | 29.00 | 45Bb |
| 0 | 60.00 | 7.00 | 12Cc |
表5. 不同浓度卡那霉素对铁皮石斛死亡数影响(17周)
Note: Capital letter means significant at 1%. Small letter means significant at 5%. Different letters indicate significant differences between treatments. The same letters indicate same significant differences between treatments.
注：大写字母表示1%极显著水平，小写字母表示5%显著水平，不同的字母表示处理间差异显著，相同字母表示处理间差异不显著。
高浓度的卡那霉素对铁皮石斛没有起到完全致死作用，既仍有部分存活植株，低浓度的卡那霉素会抑制植物生长，随着潮霉素浓度的增加，植物生长受到抑制程度就越大。从表6、图5和图6可知，当200~600 mg/L的浓度，培养时间达17周时，对铁皮石斛原球茎生长状态进行观察，发现原球茎黄绿，部分褐化，少量分化、缓慢生长，而对照组的铁皮石斛多数生长正常，逐渐分化成完整植株。50~100 mg/L浓度下生长受到一定抑制，有部分原球茎能分化形成较弱的小苗，另一部分依旧保持着原球茎的状态，且呈现出浅绿色，颜色不均匀，缓慢生长。
| 不同卡那素浓度(mg/L) Different kanamycin concentration | 生长情况 Growth | 死亡率% Mortality | 植株颜色 Plant color | 植株状态 Plant state |
|---|---|---|---|---|
| 0 | +++++ | 12Aa | 绿色 | 全部分化、正常生长 |
| 50 | +++ | 45Aab | 浅绿，部分褐化 | 部分分化、缓慢生长 |
| 100 | +++ | 48Aab | 浅绿，部分褐化 | 部分分化、缓慢生长 |
| 200 | ++ | 72ABab | 黄绿，部分褐化 | 少量分化、缓慢生长 |
| 400 | ++ | 74ABb | 黄绿，部分褐化 | 少量分化、缓慢生长 |
| 600 | ++ | 78Bc | 黄绿，部分褐化 | 少量分化、缓慢生长 |
表6. 不同浓度卡那霉素对铁皮石斛生长的影响(17周)
注：“−”代表死亡；“+”代表原球茎停滞生长，为接种时大小(5 mm)；“++”代表原球茎缓慢生长，平均大小为5~10 mm；“+++”代表原球茎正常生长，平均大小10 mm以上。“+++++”代表原球茎正常生长，平均大小15 mm以上。
图5. 卡那霉素浓度为400 mg/L原球茎生长情况
图6. 卡那霉素浓度为600 mg/L原球茎生长情况
一般说来，单子叶植物对卡那霉素的敏感程度较双子叶弱，因此，在筛选过程中，单子叶植物的筛选浓度要高于双子叶植物 [
从本实验的研究结果得出，潮霉素可以用于铁皮石斛的遗传筛选，而且，在采用本培养基配方的情况下，筛选浓度应高于30~40 g/L。铁皮石斛为单子叶植物，对卡那霉素的敏感性很低，在以原球茎为接种材料的培养基中，卡那霉素对铁皮石斛的影响极低，卡那霉素不适合作为本培养基配方下和培养材料的筛选剂。
科技部“三区”科技人才项目(A3008798)。
刘玉红,和凤美,朱永平,赵家清. 铁皮石斛原球茎对潮霉素及卡那霉素的敏感性研究 Effect Sensitivity of Hygromycin and Kanamycin on Tissue Culture Protocorms of Dendrobium officinale[J]. 植物学研究, 2019, 08(06): 486-494. https://doi.org/10.12677/BR.2019.86061