目的：探讨细胞外信号调节激酶的上游激酶(MEK)抑制剂PD98059对H2O2诱导的人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响及其作用机制。方法：H2O2诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡，PD98059干预其细胞凋亡。荧光染料吖啶橙(AO)观察细胞凋亡的形态学变化；流式细胞术法进行凋亡细胞计数；Western blot法检测p53，PCNA，caspase-3、caspase-9和Bcl-2的表达。结果：H2O2刺激细胞4 h、12 h，明显诱导了MCF-7细胞凋亡。PD98059将H2O2诱导的细胞凋亡率分别降低了约4％、14％，与H2O2刺激细胞12 h比较，具有显著的统计学差异(P < 0.05)。H2O2显著提高了p53蛋白的表达，激活了caspase-3与caspase-9蛋白，降低了Bcl-2的表达，而PD98059逆转了H2O2的刺激效应，下调了H2O2导致的p53与PCNA蛋白表达，降低了caspase-3与caspase-9蛋白活性，上调了Bcl-2蛋白表达。结论：MEK抑制剂PD98059抑制了H2O2诱导的MCF-7细胞凋亡，其作用机制与其降低了p53和PCNA蛋白表达和caspase-3与caspase-9蛋白活性以及增加Bcl-2蛋白表达有关。
Objective: to study the effect of MEK inhibitor of PD98059 on apoptosis induced by H2O2 and its mechanisms in human breast cancer MCF-7 cells. Methods: H2O2 inducing apoptosis in MCF-7 cells was set to observe apoptosis and its associated proteins treated in the present or absent of PD98059. The cellular morphology was investigated by AO staining. Apoptosis ratio was analyzed by flow cytometry. The expres-sions of p53, PCNA, caspase-3, caspase-9 and Bcl-2 were observed using Western blot analysis. Results: apoptosis was observed with cells treated H2O2 for 4 or 12 h while the degree of apoptosis was greatly de-creased by 4% or 14% in MCF-7 cells treated with H2O2 and PD98059 together. There was significantly dif-ference between with the treatment of H2O2 and PD98059 in the presence of H2O2 for 12 h (P < 0.05). The increased p53, activated caspase-3 and caspase-9 and decreased Bcl-2 were appeared with H2O2 treatment. However, the levels of p53 and PCNA were downregulated, the extent of caspase-3 and caspase-9 activation was decreased, and the level of Bcl-2 was upregulated in MCF-7 cells treated with PD98059 in the presence of H2O2. Conclusions: MEK inhibitor of PD98059 inhibited apoptosis by downregulating the levels of p53 and PCNA, decreasing the activation of caspase-3 and caspase-9 and upregulating the level of Bcl-2 in MCF-7 cells.
丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其是信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要传递者，参与多种细胞功能的调控，尤其是在细胞增殖、分化与凋亡中，起着关键作用[
MCF-7细胞由中国科学院健康所荆清课题组惠赠。PD98059购自美国Biomol公司。H2O2购自美国sigma公司。RPMI 1640培养基购自美国GIBCO公司。胎牛血清(FBS)购自美国PAA公司。牛胰岛素(Insulin)购自Sigma公司。p53(FL-393)、PCNA抗体均购自美国Santa Cruz公司。
以少量二甲亚砜(DMSO)溶解PD98059粉末，配制成6.5 mg/ml溶液(储存液)，分装置–20℃避光保存，临用时稀释成所需浓度(DMSO终浓度 < 0.1%)。H2O2以去离子水溶解，配制成10 mmol/L溶液(储存液)，置4℃避光保存。
MCF-7细胞种植在RPMI 1640培养基(含10% FBS，0.01 mg/ml Insulin，100 U/ml青链霉素混合液，20 mmol/LHEPES)中，细胞在37℃ 5% CO2环境中单层生长。
取对数生长期的人乳腺癌MCF-7细胞，接种于60 mm培养皿中。24 h后加入终浓度为200 μmol/L H2O2预处理细胞2 h后换新鲜培养液，再加入终浓度为80 μmol/L PD98059，分别于4 h、12 h后收集细胞，同时设同样条件下单独应用200 μmol/L H2O2、80 μmol/L PD98059及未经药物处理的空白对照组。PBS液洗涤2遍，制成活细胞悬液，调整细胞浓度为1 × 106/ml，取95 μl细胞悬液与5 μl吖啶橙溶液(100 μg/ml)混匀，吸1滴混合液点于洁净玻片上，直接用盖玻片封片，荧光显微镜观察，摄片。
取对数生长期的人乳腺癌MCF-7细胞，细胞处理同2.2.3中描述。适时观察，收集细胞，以不含EDTA的0.25%的胰酶进行消化。冷PBS洗细胞2次。将细胞转移至1.5 ml的离心管中。将对照组的细胞分为4管，每管中细胞浓度约1 × 106/ml。每管以400 ml 1 × 结合缓冲液悬浮。其中，一管为空白对照、一管为Annexin V单染、一管为PI单染、一管为Annex in V和PI 双染。染色法为加5 ml Annex in V-FITC，轻轻振荡混匀，4℃避光染色15 min。加10 ml PI染液，混匀，4℃避光染色5 min。药物处理过的细胞，以400 ml 1 × 结合缓冲液悬浮，再进行双染，上流式细胞仪进行。具体实验操作按照CELL LAB AposcreenTM Annexin V-FITC Apoptosis Kit试剂盒(BECKMAN COULTER)进行。
提取对照组和用药干预后的细胞总蛋白，Bradford法定量后制备western上样样品，进行SDS-PAGE电泳。电泳后，剪取与凝胶大小一致的PVDF膜及滤纸，浸于Transfer buffer中10 min，按下列顺序放置于Bio-Rad半干电转移装置上：正极 ® 滤纸 ® PVDF膜 ® 凝胶 ® 滤纸 ® 负极，15 V稳压转移30 min。5％脱脂奶粉室温封闭1 h，弃去封闭液，加入一抗(用TBST稀释)，4℃反应过夜。次日，洗膜后加入二抗，室温反应1 h，洗膜后加入ECL显色液，读片。
实验结果数据以
表示，两均数的比较用ｔ检验，P < 0.05，表示具有显著的统计学意义。
AO荧光染色对细胞凋亡的形态学观察实验结果如图1所示，正常细胞核结构正常、均呈绿色荧光(图1(A))，200 μmol/L H2O2处理细胞4 h、12 h后，荧光显微镜下观察到典型的细胞凋亡特征性变化，凋亡细胞胞核呈固缩状的或半月形绿色荧光或橘黄色荧光(图1(B，E))，与经H2O2处理组比较，80 μmol/L PD98059干预细胞4 h、12 h后，凋亡细胞减少。流式细胞仪检测的细胞凋亡率如图2所示，H2O2刺激细胞4 h、12 h，诱导的细胞凋亡率分别为19.59%、25.98%，而PD98059将其凋亡率分别降低了约4%、14%，与H2O2刺激细胞12 h比较，具有显著的统计学差异(P < 0.05)。
对p53、PCNA蛋白的实验结果如图3所示，与未经H2O2及PD98059处理的对照组比较，200 μmol/L H2O2处理细胞4 h、12 h后明显诱导了p53蛋白的表达，而80 μmol/L PD98059下调了经H2O2刺激的MCF-7细胞中p53蛋白表达，PD98059单独运用12h则完全抑制了p53蛋白的表达。与未经H2O2及PD98059处理的对照组比较，单独运用PD98059抑制了PCNA的表达，而其余各组均未明显变化。
200 μmol/L H2O2刺激MCF-7细胞4 h、12 h均激活了caspase-3与caspase-9的活性，降低了Bcl-2的表达。80 μmol/L PD98059降低了经200 μmol/L H2O2刺激下的MCF-7细胞中caspase-3与caspase-9的活性，增加了该细胞中Bcl-2蛋白的表达。单独运用PD98059干预细胞12 h则完全抑制了caspase-3与caspase-9的活性，增加了Bcl-2蛋白的表达(图4)。
乳腺癌的发生发展涉及到一系列信号转导分子活性的改变。研究表明，丝裂原活化蛋白激酶通路之一的细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)/丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号传导途径在乳腺癌的发生和发展中起着重要的作用。信号转导通路的异常活化能够导致细胞丧失凋亡和分化的能力，促使细胞恶性转化，异常增殖，产生肿瘤，并能进一步促进肿瘤细胞的增殖[
p53是重要的肿瘤抑制因子，p53通过参与细胞内的信号转导通路，调节细胞的正常生命活动，包括细胞周期，细胞增殖，细胞凋亡等[
PCNA是DNA聚合酶的辅助蛋白，是细胞周期所必需的物质，又称周期蛋白。PCNA在细胞增殖调控上起着促进DNA合成的重要作用，是评价细胞增殖状态的客观指标[
本研究用200 μmol/L H2O2刺激细胞，诱导了细胞凋亡，同时诱导了细胞中p53蛋白的表达，这与先前的研究结果一致[13,14]。实验结果显示，H2O2刺激
图1. PD98059对H2O2分别于4 h、12 h刺激的MCF-7细胞中细胞形态学变化。(A) 未经H2O2及PD98059处理的对照组(×400); (B) H2O2处理细胞4 h(×400); (C) H2O2+ PD98059干预细胞4 h(×400); (D) PD98059干预细胞4 h(×400); (E) H2O2处理细胞12 h(×400); (F) H2O2+ PD98059干预细胞12 h(×400); (G) PD98059干预细胞12 h(×400)。实验结果重复3次
图2. PD98059对H2O2分别于4 h、12 h刺激的MCF-7细胞中细胞凋亡率的影响。*，P < 0.05，与H2O2刺激MCF-7细胞12 h比较。实验数据以ｘ±ｓ表示(n = 3)
图3. PD98059对H2O2分别于4 h、12 h刺激的MCF-7细胞中p53和PCNA蛋白的影响，实验结果重复3次
图4. PD98059对H2O2分别于4 h、12 h刺激的MCF-7细胞中凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-9与Bcl-2的影响，实验结果重复3次
MCF-7细胞4 h、12 h均可诱导细胞凋亡，且刺激了MCF-7细胞中p53的高表达，当其与PD98059联合应用时，下调了p53的表达。且当单独运用PD98059时p53的表达被抑制的更明显，PD98059干预细胞12 h时则完全抑制了MCF-7细胞中p53的表达。这可能与H2O2的氧化应激反应诱导了p53介导的细胞凋亡，而PD98059对其起到了抑制作用有关。同时，PD98059干预细胞12 h时下调了PCNA的表达，而其他各组均未明显影响PCNA的表达，这可能与PD98059抑制细胞增殖有关，其具体的作用机制有待进一步研究。
细胞凋亡从内外多因子复杂的相互作用诱导产生凋亡信号，传递至caspase并使其活化开始，以蛋白底物裂解、细胞解体为结局，从而使细胞凋亡得以完成。线粒体释放的细胞色素C能与Apaf-1及caspase-9形成一个复合体，在dATP、ATP存在下活化caspase-3、caspase-6、caspase-7等成员，使凋亡进行下去[
本研究发现，经H2O2刺激的MCF-7激活了caspase-3与caspase-9蛋白，下调了Bcl-2的表达，而PD98059则降低了H2O2的效应，即PD98059降低了caspase-3与caspase-9的活性，提高了Bcl-2蛋白的表达。可见，H2O2通过caspase-3、caspase-9及Bcl-2途径诱导的细胞凋亡被PD98059阻断。
综上所述，本研究证实了H2O2可诱导细胞凋亡，同时可刺激细胞中凋亡相关蛋白p53的高表达，激活caspase-3与caspase-9蛋白，降低Bcl-2水平。MEK特异性抑制剂PD98059则抑制了胞凋亡，同时抑制了细胞中p53的表达，且其下调了细胞中PCNA的表达，降低了caspase-3与caspase-9的活性，提高了Bcl-2蛋白的表达。提示在人乳腺癌MCF-7细胞中p53、PCNA及其凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-9与Bcl-2的表达可能与MEK通路有关。
感谢上海市教委E-研究院中医内科建设计划资助项目(E03008)、上海市教委预算内科研项目(2010JW28)给予的资助。
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