左旋多巴(L-DOPA)、L-酪氨酸、曲酸、熊果苷购于阿拉丁试剂公司；酪氨酸酶购于美国Worthington公司；FEP101-896酶标板购于广州洁特生物过滤制品公司；磷酸二氢钾(KH₂PO₄)等试剂购于杭州汇普化工有限公司；珍珠层粉购于浙江长生鸟珍珠生物科技有限公司。珍珠层可溶性蛋白的制备：称取100 g珍珠层粉末置于1000 mL烧杯中，加入600 mL超纯水，调节溶液pH值为9，25˚C恒温搅拌提取15 h (搅拌速度设为150 r/min)。过滤，弃去残渣，滤液在室温下离心(6000 r/min离心15 min)，取上清，调节上清溶液的pH值为中性，真空冷冻干燥(于1.3~13帕的真空度、−10˚C~−50˚C的温度下冷冻干燥48~60小时)，得到珍珠层可溶性蛋白提取物 [ 12 ] 。

Milli-Q超纯水装置，美国MILLIPORE公司；PB-10 pH计，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；Evolution 60S紫外可见光分光光度计，美国Themo Fisher公司；iMARK酶标仪，美国Bio-Rad公司。

以L-酪氨酸为底物，在反应体系中分别加入一定量母液浓度为100 mg/mL的珍珠层可溶性蛋白质溶液、曲酸溶液及熊果苷溶液，测定它们对酪氨酸酶单酚酶活力的抑制率，实验结果如图1所示。可以看出，三者均能抑制蘑菇酪氨酸酶单酚酶的活力，其作用强度从大到小依次为：曲酸、熊果苷、珍珠层可溶性蛋白。样品终浓度呈0.625、1.25、2.5、5、10、20、40 mg/mL梯度分布，随着珍珠层可溶性蛋白溶液浓度的增加，它对单酚酶活力的抑制能力就越强。当珍珠层蛋白溶液的浓度小于0.625 mg/mL时对酶活力的抑制率较低，不到10%；当珍珠层蛋白溶液的浓度为1.25~20 mg/mL之间时对酶活力的抑制率显著增加，在浓度为20 mg/mL时抑制率达到了47.55%；当珍珠层蛋白溶液的浓度大于20 mg/mL后对酶活力的抑制率增加趋势变缓慢，样品浓度为40 mg/mL时对酶活的抑制率是54.80%。珍珠层蛋白溶液的浓度与酶活力抑制率之间存在剂量依赖关系，对其进行回归拟合，得到回归方程为 Y = 11.719 ln ( x ) + 11.816 ，R²= 0.9974，从方程可以得到，珍珠层可溶性蛋白溶液导致酪氨酸酶单酚酶活力下降50%的浓度(IC50值)

表1. 反应体系组成

为26.01 mg/mL。相较于空白组的酶反应体系，珍珠层可溶性蛋白质对酪氨酸酶单酚酶活力表现出明显的抑制效果，并且显著延长了酪氨酸酶单酚酶的迟滞时间(见图2)：当测活体系中不含珍珠层可溶性蛋白质时，酶反应的迟滞时间为189秒，在40 mg/mL的效应物浓度下其迟滞时间增大到345秒，延长了将近1.8倍。

图1. 珍珠层可溶性蛋白质对酪氨酸酶单酚酶活力的作用

图2. 珍珠层可溶性蛋白质对酪氨酸酶单酚酶迟滞时间的影响

以L-多巴为底物，在反应体系中加入一定量母液浓度为100 mg/mL的珍珠层可溶性蛋白质溶液、曲酸溶液及熊果苷溶液，测定它们对酪氨酸酶二酚酶活力的抑制率，实验结果如图3所示。结果表明，珍珠层可溶性蛋白质对酪氨酸酶二酚酶活力的抑制作用比曲酸弱，比熊果苷强。随着珍珠层可溶性蛋白质溶液浓度的增加，其抑制效果就越明显。当珍珠层蛋白溶液的浓度小于0.625 mg/mL时测得的抑制率较低，不到20%；当珍珠层蛋白溶液的浓度为1.25~20 mg/mL之间时对酶活力的抑制率显著增加，当浓度为20 mg/mL时抑制率为52.84%；当珍珠层蛋白溶液的浓度大于20 mg/mL后对酶活力的抑制率增加趋势变缓慢，当浓度为40 mg/mL时对酶活的抑制率为58.75%。珍珠层蛋白溶液的浓度与酶活力抑制率之间存在剂量依赖关系，对其进行回归拟合，得到回归方程为 Y = 9.1121 ln ( x ) + 25.544 ，R²= 0.9936，从方程可以得到，珍珠层可溶性蛋白质溶液导致酪氨酸酶二酚酶活力下降50%的浓度(IC₅₀值)为14.64 mg/mL。可以看出，曲酸对酪氨酸酶单酚酶及二酚酶的活力都具有很强的抑制作用。而α-熊果苷对单酚酶活力有强有力的抑制作用，对二酚酶活力几乎没有抑制作用(实验中未检测到IC₅₀值)，这与刘有停等 [ 17 ] 研究得出的结果相符合。珍珠层可溶性蛋白质溶液对单酚酶及二酚酶活力均有抑制作用，且对二酚酶酶活力的作用效果稍强于单酚酶。

在珍珠层可溶性蛋白质作用下，以酶促反应的初速度与添加的酶量作图得到了一组经原点的直线，如图4所示。改变反应体系中酪氨酸酶的终浓度为25、50、75、100、125 U/mL，分别测定珍珠层可溶性蛋白质终浓度为0、5、10、15、20 mg/mL时体系中酪氨酸酶的酶活力。图中随着珍珠层可溶性蛋白质浓度不断增加，直线斜率逐渐降低，说明珍珠层可溶性蛋白质抑制酪氨酸酶二酚酶的活力是以增加效应物的浓度而不是减少有效酶量起作用 [ 18 ] 。因此，珍珠层可溶性蛋白质对酪氨酸酶的抑制属于可逆型抑制。

图3. 珍珠层可溶性蛋白质对酪氨酸酶二酚酶活力的作用

图4. 不同浓度珍珠层可溶性蛋白质作用下酶反应初速度与酶浓度的关系

在200 μL的反应体系中，固定酶的浓度，改变底物L-多巴的浓度，以酶促反应的初速度与底物浓度之间的关系作图可得到一组双曲线(图略)，这说明在酪氨酸酶的作用下，L-多巴的氧化反应遵循Michaelis-Menten动力学方程，再以L-多巴浓度的倒数和反应初速度的倒数作 Lineweaver-Burk双倒数图，结果如图5所示。由图可得，随着珍珠层可溶性蛋白质溶液浓度的增大，纵轴截距不变，斜率增大，即最大反应初速度(V_max)并不受抑制剂浓度的影响，米氏常数K_m值与抑制剂浓度呈正相关，表明抑制剂浓度增大时，酶对底物的亲和力在不断下降，抑制剂的存在阻碍了底物和酶的结合，增加底物或者增加抑制剂浓度均可干扰对方与酶的结合。由此可判定珍珠层蛋白溶液对酪氨酸酶的抑制作用表现为竞争型抑制。它只能与游离酶(E)结合而不能与酶–底物配合物(ES)结合 [ 19 ] 。其竞争型抑制的动力学方程表示如下：

1 v = K m V max ( 1 + [ I ] K i ) ( 1 [ S ] ) + 1 V max (1)

K m a p p = K m [ I ] K i + K m (2)

其中V_max表示最大催化反应速率，v为酶促反应速率，用ΔOD₄₉₀/min表示，K_i、K_m和 K m a p p 分别表示抑制常数、米氏常数和表观米氏常数，[I]和[S]分别为体系中珍珠层可溶性蛋白和底物L-多巴的浓度。根据方程2作 K m a p p 与珍珠层可溶性蛋白浓度[I]关系图(插图)，图中表现出了良好的线性关系，表明珍珠层可溶性蛋白质在酪氨酸酶上只有一个或一种单独的抑制位点，拟合直线，得到直线斜率为珍珠层可溶性蛋白质对二酚酶的抑制常数(K_i)为3.360 mg/mL (表2)。