IS Immunology Studies 2330-166X Scientific Research Publishing 10.12677/IS.2016.41001 IS-18390 IS20160100000_83127370.pdf 生命科学 医药卫生 Δ42PD1稳定表达细胞系的建立及其功能的初步研究 Generation of Δ42PD1-Expressing Stable Cell line and Preliminary Research on the Function Thereof 程 林 1 2 唐 娴 1 2 曹 廷智 1 2 徐 六妹 1 2 彭 巧丽 1 2 何 云 1 2 王 辉 1 2 null 深圳市第三人民医院艾滋病临床研究实验室，广东 深圳 24 08 2016 04 01 1 7 © Copyright 2014 by authors and Scientific Research Publishing Inc. 2014 This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

目的：建立稳定表达Δ42PD1的293T细胞系，并探索其对AKT，NF-κB和Erk1/2磷酸化的影响。方法：分别将含有人PD1和Δ42PD1基因的真核表达质粒稳定转染293T细胞，用流式细胞术筛选稳定细胞系，用RT-PCR和Western blot进一步鉴定目基因的表达。将稳定细胞系分别于PBMCs进行孵育，以激活Δ42PD1和PD1，用流式细胞术检测细胞内AKT，NF-κB和Erk1/2的磷酸化水平。结果：通过流式细胞术筛选出稳定表达PD1和Δ42PD1的293T细胞系，RT-PCR和Western blot确认了目的基因的表达。与PBMC混合孵育后，293T细胞内AKT的磷酸化水平被Δ42PD1或PD1显著抑制，而NF-κB和Erk1/2的磷酸化水平没有显著变化。结论：本研究发现Δ42PD1与PD1的功能类似，可能是一种重要的抑制性免疫调节受体。 Objective: To establish Δ42PD1-expressing stable 293T cell line and explore the effect of Δ42PD1 on phosphorylation of AKT, NF-κB and Erk1/2. Methods: The human PD1- and Δ42PD1-carrying eukaryotic expression plasmids were stably transfected into 293T cells respectively. Stable cell lines were screened using flow cytometry, and confirmed by RT-PCR and Western blot. The cell lines were co-cultured with PBMC to activate PD1 and Δ42PD1, and then analyzed the phosphorylation of AKT, NF-κB and Erk1/2 via flow cytometry. Results: We obtained PD1- and Δ42PD1-stably expressing 293T cell lines by flow cytometry. The expression of genes of interest was confirmed by RT-PCR and Western blot. After co-culture with PBMC, phosphorylation of AKT but not NF-κB or Erk1/2 in 293T cells was significantly inhibited by Δ42PD1 or PD1. Conclusion: The present study found that functionally similar to PD1, Δ42PD1 could be an important inhibitory immune-regula- tory receptor.

 程序性细胞死亡受体1，Delta-42程序性细胞死亡受体1，流式细胞术，蛋白激酶B , PD1 Δ42PD1 Flow Cytometry AKT Δ42PD1稳定表达细胞系的建立及其功能的 初步研究<sup> </sup>

程林，唐娴*，曹廷智，徐六妹，彭巧丽，何云，王辉

深圳市第三人民医院艾滋病临床研究实验室，广东 深圳

收稿日期：2016年8月4日；录用日期：2016年8月21日；发布日期：2016年8月24日

 摘 要

目的：建立稳定表达Δ42PD1的293T细胞系，并探索其对AKT，NF-κB和Erk1/2磷酸化的影响。方法：分别将含有人PD1和Δ42PD1基因的真核表达质粒稳定转染293T细胞，用流式细胞术筛选稳定细胞系，用RT-PCR和Western blot进一步鉴定目基因的表达。将稳定细胞系分别于PBMCs进行孵育，以激活Δ42PD1和PD1，用流式细胞术检测细胞内AKT，NF-κB和Erk1/2的磷酸化水平。结果：通过流式细胞术筛选出稳定表达PD1和Δ42PD1的293T细胞系，RT-PCR和Western blot确认了目的基因的表达。与PBMC混合孵育后，293T细胞内AKT的磷酸化水平被Δ42PD1或PD1显著抑制，而NF-κB和Erk1/2的磷酸化水平没有显著变化。结论：本研究发现Δ42PD1与PD1的功能类似，可能是一种重要的抑制性免疫调节受体。

关键词 :程序性细胞死亡受体1，Delta-42程序性细胞死亡受体1，流式细胞术，蛋白激酶B

 1. 引言

程序性细胞死亡受体1 (programmed cell death 1，PDCD1，PD1)，是一种重要的抑制性免疫调节受体，可通过抑制T细胞和B细胞的活化信号，而下调机体免疫系统活性，进而促进自身免疫耐受和阻止自身免疫性疾病的发生 [ 1 ] [ 2 ] 。PD1的异常表达与持续性感染、肿瘤、自身免疫性疾病的发生和发展密切相关，使其成为相关疾病治疗的有效靶点 [ 3 ] [ 4 ] 。近年来，以PD1通路为靶点的中和抗体免疫疗法在恶性肿瘤治疗中显示出显著的疗效，成为肿瘤治疗领域的研究热点之一 [ 5 ] [ 6 ] 。

近年香港大学的一个研究小组发现了PD1的一种选择性剪接转录本。与全长PD1编码序列相比，该转录本框内缺失了42个碱基，因此被命名为Δ42PD1 [ 7 ] 。Δ42PD1的胞外区比PD1缺少14个氨基酸，但二者传递信号的胞内段的氨基酸序列完全相同。然而目前尚不清楚Δ42PD1是否具有功能，其胞内段是否也可以传递抑制性信号。本研究分别构建了稳定表达Δ42PD1和PD1的293T细胞系，通过与人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PMBC)混合孵育的方式活化细胞表面Δ42PD1和PD1，发现Δ42PD1与PD1一样，也可以抑制细胞内Akt的磷酸化水平。

 2. 材料和方法 2.1. 材料

真核表达质粒pIRES-PD1、pIRES-Δ42PD1和载体pIRESpuro由香港大学陈志伟教授惠赠。293T细胞由本实验室(深圳市第三人民医院肝病研究所艾滋病研究室)保存。胎牛血清和DMEM培养基均购自美国Gibco公司。嘌呤霉素购自美国Sigma公司。TRIzol试剂和转染试剂Lipofectamine 2000均购自美国Invitrogen公司。限制性核酸内切酶EcoR I和EcoR V，预染蛋白分子量标准购自Thermo公司。DNA聚合酶PrimeSTAR、DNA分子量Marker (DL2000)和反转录试剂盒(PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit)均购自大连TAKARA公司。质粒DNA提取纯化试剂盒购自Promega公司。Ficoll溶液购自GE公司。PE标记磷酸化AKT单抗、FITC标记磷酸化NF-κB单抗和APC标记磷酸化Erk均购自Cell Signaling公司，羊抗人PD1多克隆抗体、PE或HRP标记的驴抗羊IgG二抗为美国R&D公司产品。

 2.2. 方法 2.2.1. 双酶切质粒

分别取重组真核表达质粒pIRES-PD1、pIRES-Δ42PD1和载体pIRESpuro各1 μg，在1.5 mL离心管中用限制性核酸内切酶EcoR I和EcoR V于37℃水浴锅内反应2 h，产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

 2.2.2. 稳定转染

分别取0.8 μg重组质粒pIRES-PD1和pIRES-Δ42PD1，于24孔板内按照Lipofectamine 2000试剂说明书转染293T细胞。24 h后将细胞转移至25 cm2培养瓶中培养，培养基中加入1 μg∙mL−1嘌呤霉素。培养2周后，通过有限稀释法培养细胞单克隆。

 2.2.3. 流式细胞技术

有限稀释法获得单克隆细胞后，取2×105个细胞，100 μL流式缓冲液(PBS+2% FBS+0.1% NaN3)重悬，加0.5 μg 羊抗人PD1多克隆抗体，4℃避光反应30 min，流式缓冲液洗3次后，100 μL流式缓冲液中加入0.2 μg PE标记驴抗羊荧光二抗，4℃避光反应30 min，洗涤后用流式细胞仪检测，筛选出稳定表达目的基因细胞克隆，分别命名为293T-PD1和293T-Δ42PD1。流式细胞术以293T细胞作为阴性对照。

 2.2.4. RT-PCR

6孔板内接种293T、293T-PD1和293T-Δ42PD1细胞各1 × 106个。培养24 h后，用TRIzol试剂裂解细胞，按照试剂说明书提取细胞总RNA，取1 μg RNA为模板进行逆转录合成cDNA。取1 μL cDNA为模板，PCR扩增目的基因(上游引物：5'-ATGCAGATCCCACAGGCGCCCTG-3'；下游引物：5'-TCAGAGGGGCCAAGAGCAGTGTC-3')，扩增GAPDH内参基因(上游引物：5'-ACA GTC CAT GCC ATC ACT GCC-3'；下游引物：5'-GCC TGC TTC ACC ACC TTC TTG-3')反应条件为94℃预变性4 min，然后98℃ 10 s、68℃60 s，扩增35个循环，最后72℃延伸5 min，产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

 2.2.5. Western blot

293T、293T-PD1和293T-Δ42PD1细胞各取1 × 106个，加入100 μL细胞裂解液，置冰上裂解30 min，1200 g、4℃离心10 min，转移上清至新的1.5 mL离心管中，加入20 μL还原型(含DTT)蛋白上样缓冲液(6×)，100℃加热7 min，冰上放置2 min，取10 μL进行SDS-PAGE电泳和转膜。电转完成后，将PVDF膜浸入5%脱脂奶粉中，室温封闭60 min；PD1多克隆抗体(1:200稀释)，室温孵育60 min，PBS-T洗涤，用1:2000 HRP标记的二抗孵育60 min，PBS-T洗涤10 min 3次后用ECL试剂盒进行化学显影。

 2.2.6. PBMC分离

取健康人外周血10 mL抗凝血加入到50 mL离心管中，加入10 mL PBS混匀；各取5 mL Ficoll溶液加入到2个15 mL离心管中，取10 mL血液加入到Ficoll上层，800g离心20 min；吸取PBMC至新的离心管中，14 mL 1640培养基洗涤细胞2次；5 mL培养基重悬细胞，计数后备用。

 2.2.7. 信号通路磷酸化激酶检测

将293T、293T-PD1和293T-Δ42PD1细胞分别以1:2、1:10、1:50的比例与PBMC混合，室温15 min后，1000 rpm离心5 min，流式细胞术检测细胞内AKT、NF-κB和Erk1/2的磷酸化水平。

 3. 结果 3.1. 稳定表达Δ42PD1和PD1的293T细胞株的构建

用EcoRI和EcoR V对真核表达质粒pIRES-Δ42PD1和pIRES-PD1进行酶切鉴定，凝胶电泳后分别在预期的位置看到了PD1和Δ42PD1的条带(图1(a))。测序结果显示，pIRES-PD1中PD1的序列与Genbank(NM_005018)中的序列100%同源，pIRES-Δ42PD1与PD1相比缺失了42个核苷酸。将pIRES-PD1和pIRES-Δ42PD1分别稳定转染293T细胞，有限稀释法各选出10个单细胞克隆，通过流式细胞术分别筛选出相对高表达目的基因的单细胞克隆，并分别命名为293T-Δ42PD1和293T-PD1。结果如图1(b)所示，与293T阴性对照(灰色填充)相比，细胞株293T-Δ42PD1和293T-PD1(白色填充)均发生明显右移，表明目的基因可在293T细胞内得到稳定表达和细胞膜定位。为进一步鉴定目的基因的表达，我们分别提取293T、293T-Δ42PD1和293T-PD1细胞RNA和全细胞蛋白，分别用RT-PCR和Western blot的方法检测目的基因的表达。在内参基因GAPDH表达水平相当的情况下，分别在预期的位置上检测到Δ42PD1和PD1的条带，而293T细胞在相应的位置上并无任何条带(图1(c)和图1(d))，进一步明确了目的基因在293T细胞内得到了正确表达。

图1. 稳定表达Δ42PD1和PD1的293T细胞株的构建和鉴定。(a) 双酶切鉴定重组质粒；(b) 流式细胞术分析细胞表面PD1和Δ42PD1的表达；(c) RT-PCR检测PD1和Δ42PD1的转录；(d) 免疫印迹法检测PD1和Δ42PD1的蛋白表达。

 3.2. Δ42PD1的活化下调293T细胞AKT的磷酸化水平

PD1的活化可以通过其胞内段抑制T细胞AKT的磷酸化 [ 8 ] ，Δ42PD1胞内段的氨基酸序列与PD1的完全相同 [ 9 ] 。为研究Δ42PD1的胞内段是否具有抑制细胞AKT磷酸化的功能，分别将293T、293T-Δ42PD1和293T-PD1细胞分别以1:2、1:10、1:50的比例与PBMC混合，以激活Δ42PD1和PD1，利用细胞大小和胞内颗粒含量的不同，流式细胞术可以区分混合细胞中的PBMC和293T及其衍生细胞(图2(a))，进而分析293T、293T-Δ42PD1和293T-PD1细胞内AKT激酶磷酸化水平。结果发现，293T与PBMC混合后，其细胞内AKT磷酸化水平并没有发生显著变化(图2(b))，而293T-Δ42PD1和293T-PD1以1:10和1:50的比例与PBMC混合后，细胞内AKT磷酸化水平显著下调，而293T-Δ42PD1和293T-PD1细胞内AKT磷酸化水平并无显著性差异(图2(b)和图2(c))。

 3.3. Δ42PD1的活化不影响293T细胞Erk1/2和NF-κB的磷酸化水平

除了抑制PI3K-AKT信号通路外，PD1与其配体的结合还能抑制T细胞MAPK和NF-κB信号通路的激活 [ 8 ] [ 9 ] 。为研究Δ42PD1是否具有类似的功能，按前述的方法分别将293T、293T-Δ42PD1和293T-PD1细胞与PBMC混合，以激活Δ42PD1和PD1，用流式细胞术分析293T、293T-Δ42PD1和293T-PD1细胞内Erk1/2和NF-κB的磷酸化水平。结果发现，受到PBMC细胞刺激后，293T、293T-Δ42PD1和293T-PD1细胞内Erk1/2磷酸化水平都显著上调，且三者之间没有显著差别；而NF-κB的磷酸化水平均没发生显著变化(图3)。

图2. 流式细胞术分析Δ42PD1的活化对293T细胞AKT磷酸化水平的影响。(a) 流式细胞术画门策略，通过FSC和SSC从混合细胞中选出293T及其衍生细胞；(b) 293T及其衍生细胞本身(灰色填充)或与PBMC按图示的比例共培养(无填充)后，流式细胞术分析细胞内p-Akt水平；(c) 与PBMC共培养后，稳定表达PD1或Δ42PD1的293T细胞内p-Akt的平均荧光强度的汇总。蛋白表达。*P < 0.05，**P < 0.01。

图3. 流式细胞术分析Δ42PD1的活化对293T细胞Erk1/2和NF-κB磷酸化水平的影响

 4. 讨论

人PD1基因位于人2号染色体q37.3，长约10 kb，编码一个相对分子质量约为55 kDa的含288个氨基酸的跨膜蛋白。PD1是一种I型跨膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族CD28/CTLA-4家族成员，结构上包含胞外氨基端IgV样结构域、跨膜区和胞内区。其IgV样结构域与CTLA-4、CD28及ICOS的IgV样结构域具有21% - 33%同源性。胞内区含有两个酪氨酸残基，分别构成免疫受体酪氨酸抑制模体和免疫受体酪氨酸交换模体 [ 10 ] 。PD1表达于活化的CD4+T细胞、CD8+T细胞、NKT细胞、B细胞、单核细胞和树突状细胞。一旦受到其配体PD-L1 (B7-H1)或PD-L2 (B7-DC)的刺激，PD1胞内段通过疫受体酪氨酸交换模体的磷酸化，招募SHP-2，进一步在不同类型的细胞内通过不同的机制抑制AKT, NF-κB和Erk等信号通路的激活，进而阻断淋巴细胞的活化和细胞因子的释放，最终发挥免疫抑制功能 [ 3 ] [ 10 ] [ 14 ] 。

1999年，一项基于PD1基因敲除C57BL/6小鼠的研究发现，缺失PD1的实验小鼠发生肾小球肾炎、关节炎、狼疮样疾病、心脏病等一系列自身免疫性疾病，并于5周龄开始出现死亡，首次揭示了PD1缺陷与自身免疫的关系 [ 11 ] ，使PD1逐渐成为基础免疫学、肿瘤免疫学、感染免疫学、移植免疫学等多个领域的研究热点。目前已经发现人类PD1基因的30多个单核苷酸突变，其中多个等位基因被证实与系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、I型糖尿病和进展型多发性硬化的发生相关 [ 7 ] 。多种肿瘤细胞能够通过表达PD1的配体抑制细胞毒性CD8+T细胞的功能，从而逃逸免疫系统的杀伤。因此通过阻断PD1通路而增强细胞毒性CD8+T细胞的功能，以治疗肿瘤的策略的可行性，不断被不同的实验室通过不同的方法而证实 [ 12 ] [ 13 ] 。此外，在慢性持续性病毒感染过程中，病毒特异性CD8+T细胞因受到病毒抗原的长期刺激而高表达PD1，使其功能受损，不能有效清除病毒。而阻断PD1通路能够使病毒特异性CD8+T细胞保持杀伤功能，促进病毒的清除 [ 14 ] [ 15 ] 。

与PD1相比，Δ42PD1在胞外区氨基端缺少了14个氨基酸，却导致其不能与PD1的配体(PD-L1和PD-L2)相互结合，但却能刺激人PBMC分泌IL-1、IL-6、TNFα等炎症性细胞因子 [ 7 ] ，表明在PBMC中的某类细胞表面存在Δ42PD1的未知配体。然而，由于目前还未鉴定出Δ42PD1的配体，不能以纯化的配体刺激Δ42PD1，进而研究其信号传导功能。为探索Δ42PD1胞内区是否具有与PD1相同的传递抑制性信号的功能，本研究构建了稳定表达Δ42PD1和PD1的293T细胞系，并将其与表达Δ42PD1未知配体的PBMC细胞混合，然后分析Δ42PD1与其配体的相互结合对293T细胞内PI3K-AKT、MAPK和NF-κB信号通路的影响。因PD-L1广泛表达免疫细胞表面，所以在本研究以293T-PD1为系统阳性对照，以293T为系统阴性对照。293T-PD1和293T-Δ42PD1与PBMC混合后，NF-κB信号通路并没有显著被抑制，MAPK信号通路不但没有被抑制，反而被激活。可能是PBMC表面其它分子激活了293T细胞的NF-κB和Erk信号通路，导致PD1和Δ42PD1的功能被掩盖；也有可能是293T细胞与T细胞基因表达背景和信号通路活化水平的差异，因为PD1抑制NF-κB和Erk信号通路的结论主要来源于T细胞。与PBMC混合后，293T细胞内AKT磷酸化水平不变的情况下，293T-PD1和293T-Δ42PD1细胞内AKT磷酸化水平显著下调，表明Δ42PD1在与其配体结合后也可以向细胞内传递抑制性信号，可能具有重要的免疫负调控的功能。

 基金项目

国家自然科学基金(31500750)，广东省自然科学基金(2016A030313030)，深圳市科技创新基金(JCYJ20140411111718169, JCYJ20150402111430650)和深圳市医药卫生三名工程资助项目。

 文章引用

程 林,唐 娴,曹廷智,徐六妹,彭巧丽,何 云,王 辉. Δ42PD1稳定表达细胞系的建立及其功能的初步研究Generation of Δ42PD1-Expressing Stable Cell line and Preliminary Research on the Function Thereof[J]. 免疫学研究, 2016, 04(01): 1-7. http://dx.doi.org/10.12677/IS.2016.41001

 参考文献 (References) References Fife, B.T. and Pauken, K.E. (2011) The Role of the PD-1 Pathway in Autoimmunity and Peripheral Tolerance. Annals of the New York Academy of Sciences, 1, 677-704. http://dx.doi.org/10.1111/j.1749-6632.2010.05919.x Riella, L.V., Paterson, A.M., Sharpe, A.H., et al. (2012) Role of the PD-1 Pathway in the Immune Response. American Journal of Transplantation, 12, 2575-2587. http://dx.doi.org/10.1111/j.1600-6143.2012.04224.x Dai, S., Jia, R., Zhang, X., et al. (2014) The PD-1/PD-Ls Pathway and Autoimmune Diseases. Cellular Immunology, 290, 72-79. http://dx.doi.org/10.1016/j.cellimm.2014.05.006 Pedoeem, A., Azoulay-Alfaguter, I., Strazza, M., et al. (2014) Programmed Death-1 Pathway in Cancer and Autoimmunity. Clinical Immunology, 153, 145-152. http://dx.doi.org/10.1016/j.clim.2014.04.010 Zheng, P. and Zhou, Z. (2015) Human Cancer Immunotherapy with PD-1/PD-L1 Blockade. Biomark Cancer, 20, 15-18. http://dx.doi.org/10.4137/BIC.S29325 Schmid-Bindert, G. and Jiang, T. (2015) First-Line Nivolumab (anti-PD-1)Monotherapy in Advanced NSCLC: The Story of Immune Checkpoint Inhibitors and “the Sorcerers Apprentice”. Translational Lung Cancer Research, 4, 215-216. http://dx.doi.org/10.3978/j.issn.2218-6751.2015.01.12 Zhou, J., Cheung, A.K., Liu, H., et al. (2013) Potentiating Functional Antigen-Specific CD8(+)T Cell Immunity by a Novel PD1 Isoform-Based Fusion DNA Vaccine. Molecular Therapy, 21, 1445-1455. http://dx.doi.org/10.1038/mt.2013.63 Patsoukis, N., Brown, J., Petkova, V., et al. (2012) Selective Effects of PD-1 on Akt and Ras Pathways Regulate Molecular Components of the Cell Cycle and Inhibit T Cell Proliferation. Science Signaling, 5, ra46. http://dx.doi.org/10.1126/scisignal.2002796 Karyampudi L., Lamichhane, P., Krempski, J., et al. (2016) PD-1 Blunts the Function of Ovarian Tumor-Infiltrating Dendritic Cells by Inactivating NF-κB. Cancer Research, 76, 239-250. http://dx.doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-15-0748 Nishimura, H., Nose, M., Hiai, H., et al. (1999) Development of Lu-pus-Like Autoimmune Diseases by Disruption of the PD-1 Gene Encoding an ITIM Motif-Carrying Immunoreceptor. Immunity, 11, 141-151. http://dx.doi.org/10.1016/S1074-7613(00)80089-8 Zamani, M.R., Asbagh, F.A., Massoud, A.H., et al. (2015) Association between a PD-1 Gene Polymorphism and Antisperm Antibody-Related Infertility in Iranian Men. Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 32, 103-106. http://dx.doi.org/10.1007/s10815-014-0371-4 Fankhauser, C.D., Curioni-Fontecedro, A., Allmann, V., et al. (2015) Frequent PD-L1 Expression in Testicular Germ Cell Tumors. British Journal of Cancer, 113, 411-413. http://dx.doi.org/10.1038/bjc.2015.244 Ascierto, P.A. and Marincola, F.M. (2015) 2015: The Year of Anti-PD-1/PD-L1s against Melanoma and Beyond. EBioMedicine, 2, 92-93. http://dx.doi.org/10.1016/j.ebiom.2015.01.011 Velu, V., Shetty, R.D., Larsson, M., et al. (2015) Role of PD-1 Co-Inhibitory Pathway in HIV Infection and Potential Therapeutic Options. Retrovirology, 12, 182-190. http://dx.doi.org/10.1186/s12977-015-0144-x Owusu Sekyere, S., Suneetha, P.V., Kraft, A.R., et al. (2015) A Heterogeneous Hierarchy of Co-Regulatory Receptors Regulates Exhaustion of HCV-Specific CD8 T Cells in Patients with Chronic Hepatitis C. Journal of Hepatology, 62, 31-40. http://dx.doi.org/10.1016/j.jhep.2014.08.008
Baidu
map