本研究以胰蛋白酶 (Try) 为模型蛋白，将蛋白缓释微球与可降解多孔支架相结合，构建在骨修复不同阶段可控释放不同生长因子的组织工程支架。首先制备胰蛋白酶 - 聚乳酸微球 (Try-PLLA ms ， ms ： 微球 ) ，然后复合到纳米羟基磷灰石 / 聚乳酸 – 羟基乙酸 (nHA/PLGA) 中，通过超临界流体发泡制备含蛋白缓释微球的多孔支架。结果表明，制备的 Try-PLLA ms 形态良好，呈规则球形，粒径集中分布在 2~7 μm ，蛋白包封率为 80.5% ，载药量为 0.89% 。制备的 Try-PLLA ms /nHA/PLGA 复合支架孔径为 150~300 μm ，孔隙率为 50.9%~76.8% ，压缩强度 3.9~5.1 MPa ， 8 周降解率为 19.8% 。 Try-nHA/PLGA 支架及 Try-PLLA ms 微球 48 小时 Try 累积释放量达分别为 85% 和 65.2% ，而复合支架 Try 48 小时累积释放量为 32.9% ， 21 天累积释放量为 60.6% 。 Try-PLLA ms /nHA/PLGA 复合支架的抗压强度和释放规律合适，对蛋白类药物具有良好的缓释作用，有望作为具有蛋白类药物缓释功能的组织工程支架。
In order to construct a bone regeneration system that different cell factors controlled release at proper stage, Trypsin (Try) was selected as the model protein, and the composite of sustained-release microspheres and biodegradable porous scaffolds was prepared in this study. First of all, Try loaded poly-l-lactic acid microspheres (Try-PLLA ms ) were prepared, and then compounded to the nano hydroxyapatite /poly lactic-co-glycolic acid (nHA/PLGA) to build a scaffold that can release growth factors sequentially. The results showed that the Try-PLLA ms were spherical shape with diameters of 2 - 7 μm. The encapsulation efficiency of the Try in PLLA ms was 80.5%, and the loading capacity was 0.89%. The prepared Try-PLLA ms /nHA/PLGA scaffold possessed 150 - 300 μm pore diameter, 50.9% - 76.8% porosity, 3.9 - 5.1 MPa compressive strength, and 19.8% degradation at 8 weeks. The cumulative releases of Try from Try- nHA/PLGA scaffolds and from Try-PLLA ms were respectively about 85% and 65.2% at 48 hours, and that from Try-PLLA ms /nHA/ PLGA scaffolds were 32.9% at 48 hours and 60.6% at 21 days. The results demonstrated that Try-PLLA ms /nHA/PLGA scaffolds had excellent drug release performance with suitable compressive strength, which would be used as tissue engineering scaffolds with protein delivery.
PLLA和PLGA具有优良的生物相容性和可降解性，降解产物是二氧化碳和水，降解产物不会在体内聚积，降解速率可通过相对分子量控制，已广泛的用作细胞支架材料[1,2]。羟基磷灰石一直被认为是骨组织中重要的无机成分，能够诱导细胞增殖和分化[
骨再生是一个涉及到多种细胞因子作用的复杂过程[
传统制备多孔支架材料的方法有相分离法、纤维粘接及溶液浇铸–粒子沥滤法，但涉及到有机溶剂或较高的温度，会破坏生物分子的活性，突释现象也较为严重。超临界流体技术无污染、无高温、产品无有机溶剂残留、绿色环保，能将蛋白载入支架材料或微球内而不失去生物活性、对支架材料的力学性能和内部孔型有良好的控制[12-16]。
实验以胰蛋白酶(Try)为模型蛋白，采用复乳法制备Try-PLLAms，复合nHA/PLGA后经超临界流体发泡形成Try-PLLAms/nHA/PLGA复合支架。考察其蛋白缓释行为，为构建具有生长因子次第释放效果的组织工程支架奠定实验基础。
PLLA (MW= 10,000) (山东医疗器械研究所)，PLGA (山东医疗器械研究所)，nHA (国药集团化学试剂有限公司)，Try (美国Sigma公司)，BCA试剂盒(南京建成生物工程研究所)。
称取250 mg PLLA溶于5 mL二氯甲烷中组成有机相，待其完全溶解后，加入250 μL 1 mg/mL的Try溶液，至于磁力搅拌器上搅拌2 min，再加入10 mL 1% PVA磁力搅拌5 min形成乳浊液。将乳浊液加入400 mL 0.1% PVA中搅拌2 h，有机溶剂挥发后得到微粒的混悬液。将所得微粒的混悬液5000 r/min离心10 min，沉淀用蒸馏水洗涤3次，真空冷冻干燥24 h得到PLLAms。
将PLGA与nHA按一定的比例研磨，研磨时间为4 h，加入10%的PLLAms，将混合粉末放入直径为5 mm的圆柱形模具中进行压制，置于四氟乙烯圆柱体模具内并将模具放入容积为500 mL的超临界CO2不锈钢反应釜中，密封后用液泵将冷凝至0℃以下的CO2压入反应釜内，当反应釜内压力达到8 MPa时开始升温，使反应釜内温度达到35℃，通过仪器内置的热电偶和放空阀调节釜内的压力和温度，保持温度变化不超过±0.5℃，压力变化为±0.1 MPa。反应8 h后，以一定的速率放气，打开反应釜，取出样品，按以上方法，不加入PLLAms，直接加入5 mg Try，制备TrynHA/PLGA支架。
将空白和含Try的PLLAms分散到导电胶上，喷金，观察微球的表面形貌。取数块制备的复合支架，喷金后观察（JSM-5900LV，Japan）支架内部结构形态。
称取50 mg PLLAms溶解在10 mL二次水中，样品中附着在微球外的蛋白会溶解在二次水中，经抽滤后，将微粒溶解在5 mL二氯甲烷中，再加入40 mL二次水，经磁力搅拌使二氯甲烷溶剂挥发完毕，BSA蛋白即被溶解在水中，然后对蛋白溶液用0.22 μm的水膜过滤，收集滤液，按照BCA试剂盒测定蛋白含量。载药量和包封率的公式分别为：
载药量 =
× 100%，包封率 =
× 100% W1为复合微球内的药量；W2为复合微球的总的质量。W3为复合微球内药量及介质中的药量。
称量样品的干重记为G1，测量样品的长度及半径，分别记为L和R，将样品放入二次水中抽真空，使水充分的渗入到材料中，直到材料表面没有气泡冒出为止。取出样品，用滤纸吸干表面的水分，称重，质量记为G2，那么根据公式，孔隙率为：
将直径为5 mm，长度为10 mm的样品浸泡于pH 7.4的磷酸缓冲液(PBS)中，抽真空，使样品充分润湿。将完全润湿的样品放入50 mL磨口瓶中，加入一定量的PBS溶液，放入37℃恒温水浴摇床内。分别于时间点0，1，2，3，4，6，8，10，12周取样，去离子水冲洗，冻干后称重，计算质量损失，公式为：
其中，L为质量损失，M0为降解前支架的质量，MT为降解不同时间后支架的质量。
精密称取一定量的复合支架、Try-PLLAms、TrynHA/PLGA支架，以pH 7.4的PBS 10 mL为释放介质，置于37℃恒温摇床中摇动。每隔一定的时间取出20 μL上清液，并补充等量的PBS，用BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白含量，计算累积释放率。
所制备的Try-PLLAms形态良好，呈规则的球形，表面光滑，无粘连现象，但粒径大小不均匀，可能是因为在搅拌过程中转速很难在长时间保持稳定造成的，见图1。所得微球粒径分布较窄，为2~7 μm，成近似正态分布，其中，空白PLLAms的平均粒径是4.8 μm，Try-PLLAms平均粒径是6.1 μm，见图2。
图1. PLLA微球的SEM图片 (a)：空白微球 (b)：载Try的微球
图2. PLLA微球的粒径分布 (a)：空白微球 (b)：载Try的微球
制备的复合支架孔径分布在150~300 μm，孔连通性较好，具有较高的孔隙率，PLLAms均匀的分布在支架上，见图3，箭头所指为PLLAms。复合支架孔隙率50.9%~76.8%，抗压强度3.9~5.1 MPa。不同分子量的PLGA孔隙率和抗压强度见表1。
使用BCA蛋白检测试剂盒测定PLLAms的载药量和包封率，载药量为0.89%，包封率为80.5%，表明所制备的微球具有良好的载药性能。
随着降解时间的增加，支架材料的质量逐渐减小。降解到第2，4，6，8，10周时，复合支架的质量分别减少3.6%，8.3%，13.5%，19.8%，27.5%。TrynHA/PLGA支架、PLLAms和复合支架在前2天都有突释现象，但复合支架的释放速率整体上比前两者慢，见图4。Try-nHA/PLGA支架，Try 48 h累积释放量达85%以上；PLLAms，Try 48 h累积释放率为65.2%；复合支架，Try 48 h累积释放量为32.9%，21 d累积释放量为60.6%。
表1比较了不同分子量的PLGA的孔隙率和抗压
图3. 复合支架形态的扫描电镜观察
表1. 不同分子量的PLGA制得的支架材料的性质
图4. T不同体系体外蛋白释放效果比较 (a) Try-nHA/PLGA 支架；(b) Try-PLLAms；(c) Try-PLLAms-nHA/PLGA支架)
强度。随着分子量的增加，PLGA制得的支架的孔隙率和抗压强度均得到增加。这可能是因为较大分子量的PLGA使聚合物的结晶性降低，有利于超临界CO2的溶胀和气泡核的生长，形成更多的孔洞结构，所以分子量增大孔隙率也增大。而当分子量较大时，聚合物的分子链更长，链段间的有序性降低，使得聚合物链段间的反应更为激烈，聚合物链段之间相互缠绕使它们的力学强度得到增强，从而导致抗压强度的增强。而事实上，孔隙率的增大会导致抗压强度的降低，所以此结论仅适用于特定的范围内。
超临界CO2(TC= 31.1℃，PC= 73.8 bar)的密度与液体密度大小相似，具有较强的溶解能力，粘度与气体相似，扩散速率高[
用于骨修复的支架材料应具有一定的形状、力学强度、合适的孔径、孔隙率和比表面积等。一般认为支架的孔径必须大于100 μm，否则细胞和组织很难长入支架的内部，且支架内部不易得到充足的养料[
载体系统主要功能就是在局部保持药物缓慢释放，以达到药物最大的生物学性能[
保持药物活性是实验的重要环节。实验中使用2%冰醋酸溶解Try，不会引起蛋白类药物变性，冰浴机械搅拌2 h，有利于醋酸的充分挥发，使其对药物的影响降到最小。采用的超临界发泡技术也是为了保持Try的活性，从而制备具有良好生物学性能的缓释载体系统。
实验制备的Try-PLLAms/nHA/PLGA复合支架可良好的保持Try的生物活性，对Try具有良好的缓释作用，有望作为组织工程支架和生长因子缓释载体。
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