主成分分析(Principal Component Analysis, PCA)是一种用于降维的无监督算法，因该算法不需要设置参数，所以便于理解和实现，广泛用于高维数据的分析和可视化。PCA的核心思想主要是通过线性变换，将高维数据投影到一个较低维度的子空间中，实现最大化数据方差并尽量减少信息损失。该算法首先计算数据每个特征的均值，使数据均值归一化，之后计算协方差矩阵并对协方差矩阵进行特征值分解，以得到特征值和特征向量，再之后进行降维，选择特征值较大的前几个主成分，将它们所对应的特征向量构成新特征空间的坐标轴，将原始数据投影到新特征空间中，从而实现降维。

假设首先有一个数据表达矩阵 $X\in R^{n\times d}$，其中每一行代表一个细胞样本，每一列代表一个基因特征，主成分分析算法主要分为以下步骤：

(1) 首先对数据进行中心化： $\tilde{X}=X-\bar{X}$

(2) 计算标准化数据的协方差矩阵：

$C=\frac{1}{n-1}{\tilde{X}}^{\text{T}}\tilde{X}$

(3) 对协方差矩阵C进行特征值分解，得到特征值和特征向量，特征值 ${\lambda }_i$和特征向量 $v_i$满足方程： $C{v}_i={\lambda }_i{v}_i$。

(4) 选择最大的k个特征值对应的特征向量 $\left[v_1,v_2,\cdots ,v_k\right]$，将所有特征向量标准化后组成特征向量矩阵W。

(5) 将原始标准化数据投影到由前k个特征向量组成的矩阵W上得到降维后的数据矩阵 $X_k=\tilde{X}W$。

(6) 降维后的数据 $X_k$包含了数据中方差最大的k个方向的信息，因此能够有效地表示数据的主要特征。

t-分布邻域嵌入(t-SNE, t-distributed Stochastic Neighbor Embedding)是一种非线性降维算法，特别适用于高维数据的可视化，这种方法主要是关注数据的局部结构，它由Laurens van der Maaten和Geoffrey Hinton在2008年提出。t-SNE目标是将高维数据映射到低维空间中，同时尽可能保留相似数据点之间的局部结构关系，通俗来说，使高维空间中相似的数据点在低维空间中靠得更近，使高维空间中相对不相似的数据点在低维空间中分布得更远。t-SNE需要将数据点之间的相似度转换为概率，原始空间中的相似度是由高斯联合概率表示，嵌入空间的相似度由“student-t分布” [6] 表示，t分布(自由度为1)比高斯分布有更长的尾部，因此使得低维空间中的远离点更容易分开。t-SNE通过原始空间和嵌入空间的联合概率的Kullback-Leibler (KL)散度 [7] 来评估可视化效果的好坏，也就是说用有关KL散度的函数作为损失函数，然后通过梯度下降最小化损失函数，最终获得收敛结果。需要注意的是该损失函数不是凸函数，即具有不同初始值的多次运行将收敛于KL散度函数的局部最小值中，以致获得不同的结果。

假设有一个数据表达矩阵 $X\in R^{n\times d}$，其中每一行代表一个细胞样本，每一列代表一个基因特征，t-SNE算法主要分为以下步骤：

(1) 计算高维空间的相似度：对于每一对数据点 $x_i$和 $x_j$，使用条件概率表示点在给定 $x_i$时 $x_j$出现的概率。定义为：

$p_{ij}=\frac{\exp \left(-\frac{{\Vert x_i-x_j\Vert }^2}{2{\sigma }_i^2}\right)}{{\displaystyle \underset{k\ne i}{\sum }\exp \left(-\frac{{\Vert x_i-x_k\Vert }^2}{2{\sigma }_i^2}\right)}}$ (1)

其中， ${\sigma }_i$是 $x_i$的高斯核宽度，可以动态调整以确保每个点的邻域包含一个固定数量的点(通过perplexity参数)， $p_{ij}$越大表示 $x_i$和 $x_j$越相似。

(2) 对称化概率矩阵：

$p_{ij}=\frac{p_{ij}+p_{ji}}{2n}$ (2)

其中n是数据点总数。

(3) 计算低维空间的相似度：在低维空间中，t-SNE通过自由度为1的学生t分布来计算数据点间的相似度，对于每一对低维空间的数据点 $y_i$和 $y_j$，定义其相似度为：

$q_{ij}=\frac{{\left(1+{\Vert y_i-y_j\Vert }^2\right)}^{-1}}{{\displaystyle \underset{k\ne l}{\sum }{\left(1+{\Vert y_k-y_l\Vert }^2\right)}^{-1}}}$ (3)

其中， $y_i$和 $y_j$是低维空间中的数据点， $q_{ij}$越大表示 $y_i$和 $y_j$越相似。

(4) 最小化分布差异：t-SNE算法通过最小化高维空间分布 $p_{ij}$和低维空间分布 $q_{ij}$之间的差异来优化低维嵌入：

$C={\displaystyle \underset{i<j}{\sum }{p}_{ij}}\log \frac{p_{ij}}{q_{ij}}$ (4)

这里的C是基于Kullback-Leibler (KL)散度的目标函数，使用梯度下降优化C，不断调整低维点的位置 $y_j$。

均匀流形逼近与投影(UMAP, Uniform Manifold Approximation and Projection)是一种现代的非线性降维方法，广泛应用于高维数据的降维和可视化。UMAP最早由Leland McInnes和John Healy在2018年提出，其基于流形学习(Manifold Learning)的理论，它继承了流形学习 [8] 的思想，且相比于传统的降维方法(如t-SNE)，在处理大规模数据时具有更好的计算效率。UMAP能够有效地保留数据的局部和全局结构，常用于数据可视化、聚类、分类等任务。

UMAP的基本思想是：假设数据点所在的高维空间实际上是一个低维流形的高维嵌入，数据点的局部邻域关系反映了它们在低维空间中的关系，降维的目标是找到一个低维空间，使得数据在高维空间和低维空间中的局部结构尽可能一致。其基本流程包括：局部邻域建立、构建相似度图和优化嵌入空间三部分。首先是局部邻域建立，对每个数据点，UMAP首先通过计算其与其他数据点的距离来构建局部邻域，通常使用k近邻(KNN) [9] 来定义邻域。其次是构建相似度图 [10] ，通过欧氏距离、余弦相似度 [11] 等相似度度量构建一个加权图。权重越大，代表两个点在高维空间中的相似度越高。最后是优化嵌入空间，优化目标是使得低维嵌入空间的邻接关系尽可能保留原始数据的结构特征。

假设有一个数据表达矩阵 $X\in R^{n\times d}$，其中每一行代表一个细胞样本，每一列代表一个基因特征，UMAP算法主要分为以下步骤：

(1) 构建高维空间中的相似度图：相似度度量通常是基于距离度量(如欧氏距离)或基于核密度估计的概率模型。UMAP首先为每个数据点 $x_i$定义一个局部邻域，通常使用k-近邻(KNN)或者半径邻域方法。对于高维数据每一对数据点 $x_i$和 $x_j$，定义其相似度概率 $p_{ij}$，可以通过以下公式来表示：

$p_{ij}=\frac{\exp \left(-\frac{d\left(x_i,x_j\right)}{{\sigma }_i}\right)}{{\displaystyle \underset{k\ne i}{\sum }\exp }\left(-\frac{d\left(x_i,x_k\right)}{{\sigma }_i}\right)}$ (5)

其中， ${\sigma }_i$是高维空间中点的邻域大小，用来控制高维空间中邻居的密度，表示为 ${\sigma }_i=\text{mean}\left(\Vert x_i-x_j\Vert \right)$在其邻域点 $x_j$上的平均距离

(2) 构建低维空间中的相似度图：低维空间中的相似度是通过学生t分布来度量的。学生t分布具有较重的尾部，有助于处理高维数据中的噪声和离群点。低维空间中的相似度 $q_{ij}$通过以下公式表示：

$q_{ij}=\frac{\exp \left(-\frac{d\left(y_i,y_j\right)}{{\sigma }_i}\right)}{{\displaystyle \underset{k\ne i}{\sum }\exp }\left(-\frac{d\left(y_i,y_k\right)}{{\sigma }_i}\right)}$ (6)

其中， $y_i$和 $y_j$是低维空间中的数据点。

(3) 优化损失函数：UMAP通过最小化高维空间和低维空间中相似度分布之间的差异来优化低维嵌入。损失函数通过Kullback-Leibler散度(KL散度)来度量两个概率分布之间的差异：

$\text{Loss}={\displaystyle \underset{i,j}{\sum }{\left(p_{ij}-q_{ij}\right)}^2}$ (7)

$p_{ij}$和 $q_{ij}$是我们上述分别求得的高维空间和低维空间的相似度。

(4) 优化算法：UMAP就通过梯度下降算法 [12] 来优化损失函数。优化的目标是使得低维空间中的相似度分布 $q_{ij}$尽可能接近高维空间中的相似度分布 $p_{ij}$。

从10X Genomics单细胞测序技术平台( https://www.10xgenomics.com/ )下载冷冻人外周血单个核细胞Human Frozen PBMCs的单细胞测序数据。

通过基因质控指标来筛选细胞，质控指标有以下三种：(1) 每个细胞中检测到的基因数。低质量的细胞和空油滴只有少量基因，两个及以上的细胞会有异常的高基因数，这两类细胞需要被筛选。(2) 每个细胞中的UMI总数。本文设定的标准为过滤UMI数大于2500，小于200的细胞。(3) 线粒体基因组的reads比例。低质量或死细胞会有大百分比的线粒体基因组，使用PercentageFeatureSet函数来计数线粒体质控指标，本文设定的标准为过滤线粒体百分比大于5%的细胞。

MT是线粒体基因，通过 图1 我们查看线粒体read的百分比，一般情况下，我们认为细胞中线粒体含量较多，意味着细胞可能趋于死亡，所以大部分情况下线粒体的含量应该去除较大的，我们可以根据具体的情况进行分析，一般10%以内可以接受。

图2. 过滤之前的特征与特征间的相关性

图3. 过滤之后的特征与特征间的相关性

我们过滤UMI数大于2500，小于200的细胞和线粒体百分比大于5%的细胞重新查看过滤之后的特征与特征间的相关性，再次用小提琴图展示(如 图2 、 图3 所示)。

我们每个细胞分别进行检测，所以要进行标准化，本文使用NormalizeData函数对上述处理的细胞数据进行归一化处理。

如果许多基因的表达在各个细胞之间表达是恒定的，那么要区分各个细胞就要使用变化差异大的基因，这就是高变基因，在细胞数据集中寻找高表达的基因特征，有助于找到单细胞数据集中的生物信号进行下游分析。使用VariableFeatures 函数提取高变基因，之后对高变基因进行展示绘图。

通过 图4 结果展示我们可以看到SA100A9、LYZ、IGLL5等为高变基因。

使用ScaleData函数准换每个基因的表达值，使每个细胞的平均表达值为0，使细胞间方差为1，使每个基因具有相同的权重，有利于下一步分析。

可视化细胞与特征间的PCA有三种方式：(1) 使用VizDimLoadings函数，用于可视化与降维结果相关的基因，了解各个基因对主成分的贡献程度(如 图5 所示)。(2) 使用DimPlot函数，将降维技术的输出绘制在二维散点图上。每个点代表一个细胞，并且根据降维技术确定的单元嵌入进行定位(如 图6 所示)。(3) 使用DimHeatmap函数，绘制某个主成分的热图，这个热图会根据主成分得分对细胞和基因进行排序，从而允许用户直观地观察数据集中异质性的主要来源(如 图7 所示)。本文选取前五个主成分，打印每个主成分前5个贡献最大的基因，即最重要的特征基因。

为了克服在单细胞数据中在单个特征中的技术噪音，我们需要压缩数据集，并确定数据集的维数。JackStraw分析 [13] 是一种用于评估单细胞测序数据中主成分分析中各个主成分显著性的方法。它是基于随机化方法，通过将原始数据中的样本标签进行随机重排，来估计每个主成分的p值，从而判断哪些主成分不是随机噪声而是真实的信号。JackStraw分析首先随机置换数据集中的一部分(默认为1%)样本标签，并重新进行PCA分析。对于这些“随机”基因，计算其PCA分数，并与观察到的PCA分数进行比较，以确定统计显著性，分析结果为每个基因在PCA分析中的p值。如果随后运行ProjectPCA，那么这些p值代表了所有基因的显著性( 图8 )。

使用UMAP和t-SNE算法对上述处理的细胞进行聚类。perplexity参数的选择对于聚类效果至关重要，perplexity参数影响局部和全局结构的平衡，较小的perplexity，更关注局部结构，容易导致小群体紧密聚集，较大的perplexity更关注全局结构，使不同类群更加分散。通常细胞数小于1000个perplexity参数选择5至20，1000个到5000个细胞perplexity参数选择20至50，大于5000个细胞perplexity参数选择30至100。由于本文数据超过了5000个，选择perplexity参数为30 (见 图9 ， 图10 )。

在使用UMAP和t-SNE算法对细胞进行聚类后，可以对部分免疫相关基因进行分析，观察其在聚类中的表达分布，如 图11~14 表示。

对于聚类效果的评估，我们采用轮廓系数(Silhouette Score)、调整兰德指数(Adjusted Rand Index, ARI)、轮廓宽度(Within-cluster Sum of Squares, WCSS)、Dunn指数(Dunn Index)和稳定性指数(Jaccard Index)进行综合衡量，见 表1 。

其中，轮廓系数为0.42，表明大部分样本在各自聚类中具有较好的相似性，同时与其他聚类有一定的分离度；调整兰德指数为0.72，说明聚类结果与真实类别较为一致；轮廓宽度(WCSS)为1200，表明类内数据紧密度较高，聚类效果较为理想；Dunn指数为2.1，反映不同聚类之间的边界清晰度较高；稳定性指数(Jaccard Index)为0.83，表明聚类结果在不同运行之间具有较高的稳定性。这些指标表明本次聚类效果较好，能够有效区分不同的细胞群体，同时保持较高的聚类稳定性和紧密性。

由 图15 ，我们可以看到Naive CD4 T细胞是初始型CD4⁺ T细胞，尚未被抗原激活，具有分化潜能，可转化为Th1、Th2、Th17、Treg等亚型。Memory CD4 T细胞是具有免疫记忆的细胞，能快速响应相同抗原的再次入侵。CD14⁺ Mono是经典单核细胞，主要通过吞噬作用清除病原体，并可分化为巨噬细胞或树突状细胞。B细胞负责适应性免疫中的抗体生成，并能作为抗原呈递细胞。CD8 T细胞是细胞毒性T细胞，能直接杀死受感染或癌变细胞。FCGR3A⁺ Mono是非经典单核细胞，主要参与炎症反应、趋化因子分泌、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。NK细胞是自然杀伤细胞，不依赖抗原特异性，可直接杀死病毒感染细胞或肿瘤细胞。DC细胞是树突状细胞主要作用是抗原呈递，能激活T细胞并诱导适应性免疫反应。Platelet细胞是血小板细胞，主要负责止血和血栓形成，同时参与炎症和免疫调节。

我们使用基因集富集分析(GSEA)可以找到这些细胞相关的关键生物学通路，如 表2 所示。