hjbm Hans Journal of Biomedicine 2161-8976 2161-8984 beplay体育官网网页版等您来挑战！ 10.12677/hjbm.2025.152042 hjbm-109529 Articles 医药卫生 生物信息学分析肿瘤浸润免疫细胞与 视网膜母细胞瘤预后的关系
Bioinformatics Analysis of the Relationship between Tumor Infiltrating Immune Cells and Prognosis in Retinoblastoma
罗应洁 1 李才锐 2 大理大学临床医学院，云南 大理 大理州人民医院眼科，云南 大理 17 02 2025 15 02 357 367 5 2 ：2025 7 2 ：2025 7 3 ：2025 Copyright © 2024 beplay安卓登录 All rights reserved. 2024 This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ 目的：探讨肿瘤浸润免疫细胞(TIICs)在视网膜母细胞瘤(RB)患者预后中的作用，并构建基于多种免疫细胞的预后模型。方法：从GEO数据库获取RB样本和正常对照样本的基因表达谱及生存信息。(1) 使用CIBERSORT算法计算样本中不同免疫细胞的比例，进行免疫细胞浸润分析；(2) 进行Kaplan-Meier生存分析；(3) 通过LASSO回归、单因素和多因素Cox回归筛选与预后相关的免疫细胞，最终基于训练队列构建由3种免疫细胞(静息NK细胞、M0巨噬细胞和未活化CD4 T细胞)组成的预后模型；(4) 构建免疫细胞风险评分模型，并用Kaplan-Meier法评估模型；(5) 通过ROC曲线评估模型的预测能力。结果：在肿瘤样本中，树突状激活细胞、静息CD4记忆T细胞、调节性T细胞等免疫细胞活跃，而在正常样本中，初始B细胞和肥大细胞较为活跃。生存分析显示，低风险组患者的生存期显著长于高风险组。M0巨噬细胞和未活化CD4 T细胞与生存时间显著相关(P < 0.05)。结论：TIICs在RB的肿瘤微环境中起重要作用，特定免疫细胞(如M0巨噬细胞、未活化CD4 T细胞和静息NK细胞)与患者生存期显著相关。本研究构建的预后模型为临床预后评估提供了新的参考。
Objective: To investigate the role of tumor infiltrating immune cells (TIICs) in the prognosis of retinoblastoma (RB) patients, and to construct a prognostic model based on a variety of immune cells. Methods: The gene expression profiles and survival information of RB samples and normal control samples were obtained from GEO database. (1) The CIBERSORT algorithm was used to calculate the proportion of different immune cells in the sample, and the immune cell infiltration analysis was carried out; (2) Kaplan-Meier survival analysis; (3) Immune cells related to prognosis were screened by LASSO regression, univariate and multivariate Cox regression, and finally a prognostic model composed of three immune cells (resting NK cells, M0 macrophages and inactivated CD4 T cells) was constructed based on the training cohor; (4) Construct an immune cell risk scoring model and evaluate the model by Kaplan-Meier method; (5) The predictive ability of the model was evaluated by the ROC curve. Results: In tumor samples, immune cells such as dendritic activating cells, resting CD4 memory T cells, and regulatory T cells were active, while naïve B cells and mast cells were more active in normal samples. Survival analysis showed that patients in the low-risk group had significantly longer survival than those in the high-risk group. M0 macrophages and unactivated CD4 T cells were significantly correlated with survival time (P < 0.05). Conclusion: TIICs play an important role in the tumor microenvironment of RB, and specific immune cells (such as M0 macrophages, unactivated CD4 T cells, and resting NK cells) are significantly associated with patient survival. The prognosis model constructed in this study provides a new reference for clinical prognosis evaluation.
视网膜母细胞瘤，肿瘤浸润免疫细胞，预后模型，CIBERSORT
Retinoblastoma
Tumor Infiltrating of Immune Cells Prognostic Model CIBERSORT 1. 引言

视网膜母细胞瘤(Retinoblastoma, RB)是儿童最常见的眼内恶性肿瘤 [1] 。在全球范围内，已知每16,000至20,000名活产婴儿中就有1名患有视网膜母细胞瘤 [2] 。大多数病例在5岁之前被诊断出来，占所有儿童癌症的3% [3] 。近年来，RB (视网膜母细胞瘤)的预后情况与治疗手段均取得了显著进步。治疗方法涵盖了眼球摘除术、冷冻疗法、热疗、近距离放射治疗、动脉化疗、玻璃体内化疗及全身化疗等多种方式。然而，值得注意的是，多数化疗药物伴随着较大的毒性副作用，并且患者可能会出现耐药性问题 [4] 。放射治疗会增加RB患者发生第二原发肿瘤的风险 [5] ，局部治疗手段在视网膜母细胞瘤的治疗中面临效果有限等挑战，这给患儿及其家庭造成了沉重的身心负担和经济压力。当前，除了深入探究基因对肿瘤的作用机制，肿瘤免疫治疗也为晚期多种类型癌症患者开辟了新的治疗曙光 [6] 。

越来越多的文献表明，免疫细胞可以浸润肿瘤并在肿瘤进展中发挥关键作用 [7] - [9] 。例如，在Epstein-Barr病毒相关的胃癌病例中，癌细胞中PD-L1的过表达以及PD-L1阳性免疫细胞的浸润，均与肿瘤的侵袭性呈现出明显的相关性 [10] 。此外，基于肿瘤中免疫细胞浸润的不同类型、密度和位置的免疫评分可用于预测肿瘤侵袭和预后 [11] 。近几十年来，旨在阻止肿瘤进展的免疫疗法取得了快速进展，有研究显示树突状细胞、PD-1及PD-L1在视网膜母细胞瘤(RB)的诊断和预后评估中具有重要意义 [12] 。然而，与其他癌症类型相比，很少有免疫疗法应用于视网膜母细胞瘤患者 [13] 。许等人 [14] 研究了RB肿瘤样本，结果显示在晚期浸润后的肿瘤中大部分免疫细胞浸润更加严重。因此，对肿瘤免疫微环境的系统研究对于开发有效的抗肿瘤免疫疗法至关重要。本研究探讨生物信息学分析肿瘤浸润免疫细胞与视网膜母细胞瘤预后的关系，旨在为RB免疫治疗相关生物标志物的研究提供新见解。

 2. 材料和方法 2.1. 数据来源

从基因表达综合( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ )数据库中获取RB患者的RNA-seq基因表达数据和生存信息，GSE125903 (视网膜母细胞瘤：7个样本；正常对照组：3个样本)。

 2.2. CIBERSORT在RB评估中的应用

CIBERSORT是一种基于基因表达的反卷积算法，使用包含547个基因的LM22矩阵评估免疫细胞组成 [15] 。我们通过该算法分析了22种TIICs的构成及比例，排列次数设为1000次，并使用P < 0.05作为筛选标准，确保结果的准确性。

 2.3. TIICs与生存分析的关系

为了分析免疫细胞浸润水平与生存情况的关系，我们根据各免疫细胞浸润水平的中位数将患者样本分为high组和low组。然后，我们绘制了Kaplan-Meier生存曲线，以直观展示不同免疫细胞浸润水平对患者生存时间的影响。

 2.4. 预后模型的构建

首先，我们采用了CIBERSORT算法对RB (视网膜母细胞瘤)样本进行深入剖析，从中获取了关于22种不同TIICs (肿瘤浸润免疫细胞)的详尽数据。接着，为了筛选出关键的免疫细胞，我们执行了单因素Cox回归分析，并借助LASSO (Least Absolute Shrinkage and Selection Operator，最小绝对收缩和选择算子)回归模型进行了进一步的精炼。随后，我们将这两种方法筛选出的免疫细胞共同纳入了多因素Cox回归分析之中，并运用了双向逐步回归法实施了更为严格的二次筛选。经过这一系列严谨的分析流程，我们最终鉴别出了一批具有显著预后意义的免疫细胞，并在此基础上构建了一个创新的免疫细胞风险评分预后模型。根据该模型中风险评分的中位数，我们科学地将患者划分为了高风险组和低风险组。

 2.5. 统计方法与工具

我们利用R软件(4.3.3版本)进行了统计分析工作。为了直观地展示免疫细胞浸润状况，我们选用了barplot包来生成柱状图；为了揭示样本与免疫细胞表达之间的关联，我们运用了pheatmap包来绘制热图；为了探究免疫细胞间的相关性，我们采用了corrplot包来制作相关性热图；为了清晰地呈现数据的分布情况，我们则使用了vioplot包来生成小提琴图。此外，在构建预后模型的过程中，我们综合应用了Kaplan-Meier生存分析、LASSO回归、以及Cox单因素和多因素回归等多种方法。为了验证模型的预测效能，我们借助timeROC包进行了ROC曲线分析。所有统计检验的P值均小于0.05，表明结果具有统计学上的显著差异。

 3. 结果 3.1. RB样本和正常对照样本中的免疫细胞浸润情况

通过CIBERSORT算法，我们分析了各样本的免疫细胞浸润情况，得到了不同免疫细胞的占比( 图1~3 )。在肿瘤样本中，树突激活细胞、静息CD4记忆T细胞、调节T细胞、嗜酸性粒细胞、记忆激活CD4 T细胞等保持活跃状态，在正常样本中B细胞、肥大激活细胞、中性粒细胞保持活跃状态。

Figure 1. Proportion analysis of different cell types in high-risk and low-risk scoring populations--图1. 不同细胞类型在高风险评分和低风险评分群体中的比例分析-- Figure 2. Proportions of different immune cells in multiple samples (GSM3584491 to GSM3584498)--图2. 不同免疫细胞在多个样本(GSM3584491到GSM3584498)中的比例-- Figure 3. TIICs correlation heat map--图3. TIICs相关性热图-- 3.2. 生存分析

生存分析结果( 图4 )显示，根据风险评分将患者分为高风险组和低风险组后，低风险组患者的总体生存期显著长于高风险组(P < 0.0001)，这一差异具有极高的统计学显著性。从生物学意义的角度来看，这一结果进一步验证了风险评分模型的可靠性和临床实用性。低风险组患者生存期的显著延长可能与其肿瘤微环境中免疫细胞的浸润模式密切相关。这种免疫微环境的差异可能导致低风险组患者的抗肿瘤免疫反应更为有效，从而抑制肿瘤进展并延长生存期。

Figure 4. Relationship between tumor infiltrating immune cells (TIICs) and prognosis in retinoblastoma (RB) cells--图4. TIICs与RB细胞预后的关系-- 3.3. 免疫细胞风险评分 Figure 5. LASSO regression analysis--图5. LASSO回归分析-- Figure 6. Univariate Cox regression analysis--图6. 单因素Cox回归分析-- Figure 7. Multivariable Cox regression analysis--图7. 多变量Cox回归分析--

将22种TIICs经过Lasso回归分析筛选到9个与预后相关的免疫细胞( 图5 )。9个预后相关的免疫细胞的单因素Cox回归分析( 图6 )，其中这九种细胞的P值都小于0.05，具有生物学意义。将初步筛选得到的9种免疫细胞纳入多因素Cox回归后最终得到3种细胞，应用多变量Cox回归分析建立基于训练队列的3个预后细胞(NK cells resting、Macrophages M0和T cells CD4 naïve)组成的预后模型( 图7 )，表明Macrophages M0和T cells CD4 naïve P值小于等于0.05，具有生物学意义。

 3.4. 构建免疫细胞风险评分预后模型并采用Kaplan-Meier法评估模型 Figure 8. Prognosis of NK resting cells--图8. NK静息细胞预后-- Figure 9. Prognosis of M0 macrophages--图9. M0巨噬细胞预后-- Figure 10. Prognosis of CD4 resting T cells--图10. CD4静息T细胞预后-- Figure 11. ROC curve for model evaluation--图11. ROC曲线评估模型-- Figure 12. Prognostic accuracy of the prognostic model compared to other clinical characteristics--图12. 预后模型与其他临床特征相比的预后准确性--

由 图8~10 预后模型构建和评估结果可知，构建的预后模型均具有研究的意义。绘制ROC曲线来探讨模型的预后预测价值，AUC (曲线下面积)是ROC曲线的一个重要指标，用于量化模型的总体预测能力，计算1、3、5年AUC值分别为0.731、0.647和0.691，AUC值介于0.5 (无预测能力)和1 (完美预测)之间。表明该模型有较好的预测性能见 图11 。同时 图12 中高风险模型AUC为0.735，表明风险评分在预测中具有相对较高的准确性，AUC值大于0.7，表明其能够较好地区分预测结果。

 4. 讨论

本研究通过分析视网膜母细胞瘤(RB)患者肿瘤浸润免疫细胞(TIICs)的浸润程度，构建了一个基于免疫细胞的预后模型，并探讨了TIICs与RB患者预后的关系。研究结果表明，TIICs在RB的肿瘤微环境中扮演了重要角色，且特定的免疫细胞(如巨噬细胞M0、未活化CD4 T细胞和静息NK细胞)与患者的生存期显著相关。肿瘤微环境中的免疫细胞浸润是影响肿瘤进展和预后的关键因素之一。本研究通过CIBERSORT算法分析了RB样本中多种免疫细胞的浸润情况，发现树突状激活细胞、静息CD4记忆T细胞、调节性T细胞等在肿瘤样本中保持活跃状态，而在正常样本中则以初始B细胞和肥大细胞为主。RB的肿瘤微环境中存在显著的免疫抑制状态，可能通过调节性T细胞和巨噬细胞等抑制性免疫细胞介导免疫逃逸 [16] 。此外，巨噬细胞M0的高浸润与较差的预后相关，提示其在RB中可能通过促进肿瘤血管生成或抑制抗肿瘤免疫反应来影响疾病进展 [17] 。

通过Kaplan-Meier生存分析和Cox回归分析，本研究发现巨噬细胞M0和未活化CD4 T细胞与RB患者的生存期显著相关(P < 0.05)。巨噬细胞是TME中关键的免疫调节细胞，根据其功能表型可分为促炎的M1型和免疫抑制的M2型。而M0巨噬细胞作为未极化的中间状态，具有高度的可塑性，其功能受TME中细胞因子和信号通路的调控。巨噬细胞M0作为未极化的巨噬细胞，可能在肿瘤微环境中分化为促肿瘤的M2型巨噬细胞，进而促进肿瘤的生长和转移 [18] 。未活化CD4 T细胞的高浸润可能与免疫抑制性微环境相关，这些细胞可能通过分化为调节性T细胞进一步抑制抗肿瘤免疫反应 [19] 。此外，静息NK细胞的低浸润与较差的预后相关，提示NK细胞在抗肿瘤免疫中的重要作用 [20] 。这些发现为理解RB的免疫微环境提供了新的视角，并强调了特定免疫细胞在预后评估中的潜在价值。本研究通过LASSO回归和多因素Cox回归分析，筛选出巨噬细胞M0、未活化CD4 T细胞和静息NK细胞作为预后相关的关键免疫细胞，并构建了一个基于这三种细胞的预后模型。该模型在训练队列和验证队列中均表现出良好的预测性能，ROC曲线分析进一步证实了其准确性，本研究的模型为RB患者的预后评估提供了一个新的工具，可能有助于指导临床决策和个性化治疗。尽管本研究取得了一些有意义的结果，但仍存在一些局限性。首先，本研究的数据来源于公共数据库(GEO)，样本量相对较小，可能存在选择偏倚，因此可看作生物信息学分析层面的探索性研究，其次，本研究仅基于转录组数据进行分析，未能结合基因组、蛋白质组等多组学数据进行更全面的验证。未来的研究可以扩大样本量，并结合实验验证(如流式细胞术或免疫组化)来进一步确认免疫细胞的浸润情况及其功能。此外，本研究的结果需要在独立的前瞻性队列中进行验证，以提高其临床应用的可靠性。

综上所述，本研究在生物信息学分析层面揭示了免疫细胞在RB中的重要作用，并构建了一个基于免疫细胞的预后模型。该模型为RB患者的预后评估提供了新的视角，并可能为未来的免疫治疗策略提供理论依据。未来的研究应进一步验证该模型的临床应用价值，并探索其在个性化治疗中的潜力。

 NOTES

*通讯作者。

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