动物实验经大连海洋大学动物保护与利用委员会批准。

健康的红鳍东方鲀(雄雌随机混合)，从中国辽宁省大连市大连天正实业有限公司获得。实验开始前，这些鱼被安置在300升装有循环海水的水槽中适应一个月，期间水体的溶解氧(Dissolved Oxygen, DO)维持在7.5 ± 0.5 mg/L，温度控制在21 ± 0.5℃。在正式实验时，通过向水中泵入氮气来降低缺氧实验箱内的溶解氧至2.5 ± 0.5 mg/L。随后，我们随机选择了24尾红鳍东方鲀，并平均分配到常氧组(Control Group, CL; DO: 7.5 ± 0.5 mg/L)和低氧组(Treatment Group, TL; DO: 2.5 ± 0.5 mg/L)，每组各12尾鱼。整个实验持续时间为10 d，在实验中，氧浓度测量使用氧气监测仪(DO-Y100，中国武汉)。实验结束时，分别从对照组和试验组中随机抽取9尾鱼。在取样过程中，使用三卡因甲磺酸盐(MS-222, Sigma, Redmond, WA, USA)麻醉实验鱼，同时并记录下实验鱼体重(26.82 ± 8.10 g)和体长(10.42 ± 1.31 cm)。然后解剖各样品肝脏组织，并立即放入到无酶管，使用液氮快速冷冻。为了确保后续分析的一致性和代表性，我们将每个条件下取得的9个肝脏样本各自分成三份混合，从而得到两组(常氧组和低氧组)各6个混合样本。所有样本研磨混样完毕后，保存在−80℃超低温冰箱，以待后续进一步分析。

选取常氧组(CL; CL11, CL21, CL31)和低氧组(TL; TL11, TL21, TL31)的肝脏组织共6个样本进行文库的构建和测序，并委托北京诺禾致源科技股份有限公司进行DNA提取及检测。样品DNA检测合格后，使用Covaris S220 (Covaris, USA)将DNA片段化至200~400 bp，然后使用亚硫酸氢盐处理ssDNA片段，转换未甲基化的胞嘧啶。在对DNA片段进行甲基化测序接头连接、大小选择和PCR扩增等步骤后，使用文库试剂盒(Accel-NGS Methyl-Seq DNA Library Kit (wift, USA))建库。然后在Agilent 5400系统(Agilent, USA)上评估文库质量，使用Illumina平台(Illumina, USA)进行对端测序。

选取常氧组(CL; CL21, CL22, CL32)和低氧组(TL; TL21, TL22, TL32)的肝脏组织共6个样本进行文库的构建和测序，并委托北京诺禾致源科技股份有限公司进行RNA提取及检测。按照NEB普通建库方式进行cDNA文库的构建，建库试剂盒使用NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina (NEB, #: E7530L)，所有的文库制备步骤均按照试剂盒说明书进行：首先通过磁珠富集带有poly A尾的mRNA，在逆转录酶体系中合成单链cDNA。然后以dNTPs为原料，在DNA聚合酶I系统中再合成双链cDNA。双链cDNA经过末端修复后，加入poly A尾和测序接头到文库中。用AMPure XP beads筛选370~420 bp左右的cDNA，进行PCR扩增并再次使用AMPure XP beads纯化PCR产物，最终获得制备好的文库。然后在Agilent 5400系统(Agilent, USA)上评估文库质量，使用Illumina平台(Illumina, USA)进行对端测序。

首先使用FastQC对公司返回的原始数据进行质控，Trimmomatic-0.39 [14] 过滤接头和低质量的读段数(Reads)，从而获得干净的读段(Clean Reads)且所有下游分析都是基于高质量的clean reads进行的。利用Bismark/0.23.1 [15] 将clean reads与红鳍东方鲀参考基因组(fTakRub1.2, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/63 )进行比对，同时进行了甲基化位点检测、序列类型比例统计、C 位点甲基化水平分析。然后使用R语言包methylKit [16] 设定500 bp为一滑动窗口且qvalue < 0.05 & methylation diff ≥ 10%为标准筛选差异甲基化区域(Differentially Methylated Regions, DMR)，接着使用R语言包genomation将差异甲基化区域注释到红鳍东方鲀参考基因组，从而获得对应的差异甲基化基因(Differentially Methylated Genes, DMG)。然后根据筛选出的DMGs，利用R语言包clusterProfiler v4.8.3进行基因本体论(Gene Ontology, GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)富集分析。

首先使用FastQC对公司返回的原始数据进行质控，Trimmomatic-0.39过滤接头和低质量的读段数(Reads)，从而获得干净的读段(Clean Reads)，所有下游分析都是基于高质量的clean reads进行的。将获得的clean reads与红鳍东方鲀参考基因组(fTakRub1.2)进行比对，然后使用Hisat2 v2.1.0将获得的clean reads比对到参考基因组上，再通过SAMtools v1.7进行排序去重，使用HTSeq v0.11.2统计比对到每个基因上的read counts。然后利用R语言包DESeq2v3.10进行基因差异分析，并以p.adj < 0.05且|log2 FoldChange| > 1 (q值 < 0.05且两组之间基因表达量的比例变化在2倍以上)为阈值筛选出差异表达基因(Differentially expressed genes, DEG)。然后在筛选出DEGs的基础上，利用R语言包pheatmap v1.0.12绘制热图。然后基于筛选出的DEGs，利用R语言包clusterProfiler v4.8.3进行基因本体论(Gene Ontology, GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)富集分析，且此方法已在师兄以往的研究文章中发表 [17] 。最后以baseMean > 10作为阈值对CL vs TL条件下的转录组KEGG富集数据进行GSEA分析(Gene Set Enrichment Analysis, GSEA)。

以参考基因组红鳍东方鲀基因位置文件为基础，使用R语言关联转录组数据GSEA (KEGG)富集结果和甲基化数据KEGG富集结果，分别绘图对比CL和TL组内基因转录组和甲基化的表达情况。然后以甲基化KEGG富集结果P < 0.05与转录组GSEA (KEGG)基因集富集结果P < 0.25为标准，筛选出CLvsTL组间在甲基化KEGG和转录组GSEA (KEGG)同时出现富集的通路及通路中同时富集的基因。

在为期10天的实验过程中，我们观察到低氧环境对红鳍东方鲀的行为产生了显著影响。相较于常氧组，低氧组的鱼群表现出明显的活动性下降：它们大量聚集于水槽底部，游动迟缓，并且表现出消极的摄食行为。此外，在取样时，我们发现低氧组的红鳍东方鲀鱼鳍普遍出现了充血现象，这可能是低氧胁迫下的一种应激反应。在此基础上，我们随机采集了9尾常氧组红鳍东方鲀(体重：30.03 ± 9.94 g，体长：10.38 ± 1.80 cm)和9尾对照组红鳍东方鲀(体重：23.60 ± 4.15 g，体长：10.46 ± 0.62 cm)的肝脏样本，肝脏组织被提取并立即冷冻保存，以便进行DNA和RNA的分离。所提取的DNA将用于全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)，以评估甲基化模式的变化；而RNA则将用于转录组测序(RNA-Seq)，以探究基因表达谱的改变。通过对这两个层面的数据进行综合分析，我们期望能够揭示低氧胁迫对红鳍东方鲀肝脏造成的分子水平上的影响，包括表观遗传修饰与基因表达之间的潜在联系。

WGBS建库数据如 表1 所示：每个样本平均获得152,307,128个读数，对原始数据进行过滤后，干净数据平均获得150,818,786个读数且准确率 ≥ 98.97%, Q30比例 ≥ 88.42%，GC含量 ≥ 24.08%。此外，将测序得到的数据与红鳍东方鲀参考基因组对比(如 表2 )，发现每个样本与基因组的比对率 ≥ 72.21%，BS转化率都在99%以上，表明WGBS测序数据的质量良好。

通过对各样本甲基化类型及甲基化位点比对鉴定，发现CG序列环境下65.11%~67.09%的胞嘧啶发生了甲基化，而CHG环境下发生的胞嘧啶甲基化比例仅为0.39%~0.41%，CHH环境下发生的胞嘧啶甲基化比例仅为0.42%~0.48% (如 表3 )。因此，在三种甲基化类型中mCpG为甲基化主要方式。

对不同类型甲基化C位点比例进行分析，发现所有甲基化胞嘧啶位点中，CG类型甲基化胞嘧啶所占比例为97.29%~95.90%，CHG类型甲基化胞嘧啶所占比例为1.15%~1.21%，CHH类型甲基化胞嘧啶所占比例为3.18%~3.58%，说明甲基化主要发生在CG位点上(如 图1 )。

我们将甲基化数据以500 bp为一窗口划分且qvalue < 0.05 & methylation diff ≥ 10%为标准，筛选出差异甲基化区域(Differentially Methylated Regions, DMRs) 450个，其中hyper (高甲基化区域) 238个、hypo (低甲基化区域) 212个，绘图展示CLvsTL在染色体水平上的总体差异(如 图2(a) )。我们还确定了DNA甲基化变化的基因组分布和与CpG岛相关的DMRs的分布，发现13%位于启动子区，31%位于外显子区，33%位于内含子区，24%位于基因间区域( 图2(b) )。位于CpG岛的DMRs占19%，大多数位于“非CpGi地区”( 图2(c) )。

我们对从红鳍东方鲀肝脏中提取出的450个DMRs进行了全基因组比对，并成功注释了541个差异甲基化基因(Differentially Methylated Genes, DMGs)。其中282个DMGs甲基化水平上调，259个DMGs

甲基化水平下调。为了研究与这些DMGs关联的功能与通路，我们进行了GO富集和KEGG富集分析。根据GO富集结果( 图3(a) )，DMGs共富集在2142个GO条目，筛选得到了249个显著富集条目(p value < 0.05)，其中以树突棘(Dendritic Spine)、mRNA加工(mRNA Processing)、突触后膜(Postsynaptic Membrane)、突出后致密(Postsynaptic Density)和突出后致密膜的组成成分(Integral Component of Postsynaptic Density Membrane)等条目富集结果最为显著，提示这些DMGs可能与神经元结构和功能密切相关。通过KEGG富集分析，我们获得了175个富集通路，其中14个通路显著富集(p value < 0.05)。如 图3(b) 所示：DMGs显著富集在轴突导向(Axon Guidance)、钙信号通路(Calcium Signaling Pathway)、谷氨酸能突触(Glutamatergic Synapse)、MAPK信号通路(MAPK Signaling Pathway)、多巴胺能突触(Dopaminergic Synapse)和Apelin信号通路(Apelin Signaling Pathway)等。这些结果表明，在低氧胁迫条件下，红鳍东方鲀肝脏中的DMGs可能参与一系列与细胞通讯、神经传递和应激反应有关的关键生物学过程。

RNA-seq建库数据如 表4 所示：每个样本平均获得72,705,402个读数，对原始数据进行过滤后，干净数据平均获得69,190,674个读数且准确率 ≥ 92.33%，Q20比例 ≥ 98.16%，Q30比例 ≥ 96.36%，GC含量 ≥ 50.14%。此外，将测序得到的数据与红鳍东方鲀参考基因组对比(如 表5 )，发现每个样本与基因组的

比对率 ≥ 96.21%，说明RNA-seq测序数据的质量良好。

我们采用HTSeq v0.11.2软件对每个基因的read counts进行定量统计，随后基于R语言平台的DESeq2 v3.10软件包进行差异表达分析。通过设定严格的筛选标准(CLvsTL组间比较，p.adj < 0.05且|log2 FoldChange| > 1)，我们成功鉴定出具有显著表达差异的基因(Differentially Expressed Genes, DEGs)。如 图4(a) 示：我们发现了762个DEGs，其中343个DEGs基因上调、419个DEGs基因下调。同时我们通过R语言进行了差异基因聚类分析和主成分分析。如 图4(b) 示：红色区域代表高表达基因、绿色区域代表低表达量基因、根据表达量可以很明显区分CL与TL两组之间差异表达的基因，同时我们也可以看到组内基因的表达量差异很小，这说明同一处理组之间的生物重复性良好，也证明了我们实验的合理性。

为了深入了解DEGs在低氧胁迫条件下红鳍东方鲀肝脏中所发挥的生物学功能，我们进行了GO富集分析( 图5(a) )和KEGG富集分析( 图5(b) )。根据GO富集结果，发现762个DEGs共富集到了2347条目术语上，显著富集了239个条目术语(p value < 0.05)，其中炎症反应(Inflammatory Response)、对细菌的防御反应(Defense Response to Bacterium)、内质网腔(Endopeptidase Inhibitor Activity)、脂肪酸代谢(Fatty Acid Metabolic Process)和细胞铁离子稳态(Cellular Iron Ion Homeostasis)等显著富集，这些显著富集的功能类别提示了两组样本在能量代谢、稳态调节和免疫响应等方面存在显著差异，表明低氧环境可能对这些关键生理过程产生了重要影响。根据KEGG富集结果，我们发现762个DEGs共富集到了234个信号通路上，其中有27条信号通路显著富集(p value < 0.05)。其中MAPK信号通路富集的DEGs最多，富集了28个DEGs，其次是TGF-β信号通路(18)、AMPK信号通路(18)和胰岛素信号通路(18)以及HIF-1信号通路富集了15个DEGs。这些通路与细胞增殖、凋亡、代谢调节及应激反应密切相关，进一步证明了低氧胁迫对红鳍东方鲀肝脏组织中多种生物学过程的影响。

为了后续进行联合分析，我们对KEGG结果进行GSEA基因集富集分析。如 图6 所示：胰腺分泌(Pancreatic Secretion)在GSEA结果中排名第一、HIF-1信号通路和TGF-β信号通路等在结果中也明显富集。

为了深入探究红鳍东方鲀在常氧组(CL)和低氧组(TL)条件下甲基化水平与转录组表达之间的关系，我们利用R语言将差异甲基化区域(DMRs)和差异表达基因(DEGs)与红鳍东方鲀参考基因组进行了关联整合。随后，我们对两组数据的甲基化程度和转录组表达水平进行了整体比对，并分别展示了它们的相关性(见 图7(a) 和 图7(b) )。如 图7 所示，在常氧组和低氧组的数据中均观察到了一种趋势随着甲基化程度的升高，转录组表达水平呈现出下降的趋势。这种负相关关系表明，DNA甲基化可能通过抑制基因表达来调控红鳍东方鲀在不同氧环境下的生理适应。以甲基化KEGG富集结果p < 0.05与转录组GSEA(KEGG)基因集富集结果p < 0.25为标准，我们筛选出了7个在甲基化KEGG和转录组GSEA(KEGG)同时出现富集的通路(Glutamatergic Synapse; Axon Guidance; Pancreatic Secretion; Insulin Secretion; Calcium Signaling Pathway; Inflammatory Mediator Regulation of TRP; Oxytocin Signaling Pathway)。对比富集在通路中的基因，发现有10个基因富集在两组数据的同一通路中(如 表6 )。