松属是松科最大的属，全球约120种，主要分布于北半球(最北至北极地区)，是北亚热带、北温带高山针叶林及干旱林地的主要成分，仅苏门达腊松(Pinus merkusii Jungh. & de Vriese)一个种分布于印度尼西亚的苏门答腊岛(Sumatra Island)。苏门答腊岛也是世界上第6大岛屿，面积47万平方公里，位于北纬7度与南纬7度之间，赤道穿过岛的中部，年降雨量在4000 mm以上，常年高温多雨，为热带雨林气候。在北半球白垩纪(1.45亿年前至6600万年前)和新生代地层(6500万年前至今)中，发现了大量的松属植物化石，当时应该是北半球森林的主要构成成分。松树的树脂被埋藏于地下，经过数千万年的地质演变，有可能转化为琥珀。琥珀内可能包裹有蜜蜂、蜻蜓、苍蝇、蚂蚁、树叶、果实、种子等，具有考古价值。松属植物凭借分化出遗传多样的物种，在全球多样的生态系统中扩张 [1] - [7] 。

松属植物是重要的造林和绿化树种，是木材、纸浆、松脂、家具等工业材料的来源 [1] - [7] 。松花粉、松针等可药用。种子可榨油。松子仁中含有100多种营养成分，是有机食品。纯烘烤、非油炸的松子仁，松香浓郁，是每日坚果中的佳品，如，赤松Pinus densiflora的种仁。利用松子仁制作的美食种类很多，例如，松子鲈鱼、松仁八宝饭、核桃松子粥、松仁意面、松子糕等。松仁也可加入到饼干、巧克力、法式坚果面包棒、燕麦酸奶杯(减脂早餐)中，制成各种甜食。松子仁已有3000多年的食用和药用历史。松仁、叶、根、花粉、幼枝等也是中药材。松属植物具有重要的食用、药用、生态和科学研究价值 [1] - [7] 。

注：*外类群。

松属植物根据表型特征(针叶及每束内针叶的数目、叶鞘、树脂道、维管束、种鳞及鳞脐、雌雄球果、种子、种皮、种翅等)分类，由于表型性状的表现存在个体间差异以及季节和地区间差异，不同学者擅长的知识和技术领域不同，对形态特征的理解和判断不同，对活植物或标本的名称鉴定结果有可能不一致，前人提出过多个属下分类方案，争议较大 [1] - [7] 。松属植物的物种鉴定研究经历了形态学、细胞学、孢粉学、化学成分、PCR-RFLP、SSR标记、DNA条形码技术等阶段，上述方法的信息量较少、分辨能力有限 [1] - [11] 。近年，叶绿体全基因组序列数据已广泛应用于植物的物种鉴定和系统发生学研究，信息量较大，增加了物种分辨率 [4] [7] - [29] 。为促进松属植物的资源保护和可持续利用，本文报道在分子水平上鉴定松属植物资源遗传多样性的一种新方法。

选取7份样品代表松属的3个种。供试样品名称及其叶绿体基因组的序列号如 表1 ( https://www.ncbi.nlm.nih.gov )。根据本团队研发的方法 [19] - [29] 编制分子分类检索表。利用MAFFT v7.055b软件 [30] ( http://mafft.cbrc.jp/alignment/software )获得比对序列矩阵。比对后的序列矩阵的长度为120,576个核苷酸，由左向右，左端(5’-端)起的第1个核苷酸字母的位置编号为1，最右端的核苷酸字母的位置编号为120,576。用MEGA 7.0 [31] 和DnaSP v6软件 [32] 检测核苷酸变异位点( 图1 和 表2 )。每个物种的特有单核苷酸多态位点作为分子分类性状，用于编写松属供试样品的分子分类检索表(见 图1 )。松科云杉属Picea A. Dietr.的鱼鳞云杉Picea jezoensis (Siebold & Zucc.) Carrière、喜马拉雅红杉Larix himalaica以及新疆落叶松L. sibirica为外类群( 表1 和 图2 )。用MEGA 7.0软件 [31] 的Tamura 3-parameter model参数模型推断系统发生关系( 图2 )。

注：*该列的序号与检索表内的序号对应；1a：马尾松Pinus massoniana，2a：黑松P. thunbergii，3a：赤松P. densiflora。**核苷酸变异位点数(在4种碱基中的占比)；***此列括号中，前一个数字是在物种特有变异位点总数(535)中所占的比例；后一个数字是在全部核苷酸变异位点总数(632)中所占的比例。

松属供试样品的叶绿体基因组的长度为119,718 (MW599991.1，黑松Pinus thunbergii Parl.)~119,875 (MK285358.1，赤松P. densiflora Siebold & Zucc.)个核苷酸。在比对序列中，共检测到632个核苷酸变异位点，占叶绿体基因组序列全长的约0.53%。其中，各物种的特有单核苷酸多态位点数目合计为535个，占变异位点总数的84.65%。马尾松(252)的特有单核苷酸多态位点的数量最多，随后依次是赤松(175)和黑松(108)。马尾松的特有单核苷酸多态位点中，T的比例(29.37%)最高，随后依次是C (25.79%)、A (22.62%)和G (22.22%)，G的比例最低，总体上差异较小。黑松的特有单核苷酸多态位点中，T (36.11%)的比例较C (12.96%)的比例高2.7倍，较G (20.37%)的比例高1.7倍。A (30.56%)的比例略低于T的比例，是G的比例的1.5倍，是C的比例的2.3倍。赤松的特有单核苷酸多态位点中，T (31.43%)和A (28.57%)的比例明显高于C或G的比例( 表2 )。物种特有的单核苷酸多态位点的数量和核苷酸构成存在种间差异。利用物种特有的单核苷酸多态位点，编制分子分类检索表，供试样品得到精准鉴定( 图1 和 图2 )。

图1. 基于叶绿体基因组的物种特有的单核苷酸多态位点的松属3个种的分子分类检索表

中国数字植物标本库( http://www.cvh.ac.cn/ )的数据显示，中国采集松属植物标本的最早记录是1901年，经过120余年的积累，来自国内外的松属植物标本数量共计17,899份，160个种/亚种/变种，包括形态特征图片和文字描述。存在同名异物和同物异名现象( https://tnrs.biendata.org/ 及 https://powo.science.kew.org/ )，例如，Pinus cooperi C.E. Blanco是库氏亚利桑那黄松(变种)Pinus arizonica var. cooperi Farjon的异名；Pinus balfouriana var. austrina (R.J. Mastrog. & J.D. Mastrog.) Silba是内华达狐尾松(亚种)Pinus balfouriana subsp. austrina R.J. Mastrog. & J.D. Mastrog.的异名；Pinus stankewiczii (Sukaczev) Fomin是秕糠土耳其松(变种)Pinus brutia var. pityusa (Steven) Silba的异名；Pinus caribaea subsp. hondurensis (Loock) Silba是洪都拉斯松(变种)Pinus caribaea var. hondurensis (Sénécl.) W.H. Barrett & Golfari的异名；Pinus discolor D.K. Bailey & Hawksw.以及Pinus johannis Rob.-Pass.是Pinus cembroides var. bicolor Little的异名；Pinus contorta subsp. latifolia (Engelm.) Critchf.是宽叶扭叶松(变种)Pinus contorta var. latifolia Engelm.的异名；Pinus murrayana Balf.是加州扭叶松Pinus contorta var. murrayana (Balf.) S. Watson的异名；Pinus fenzeliana var. dabeshanensis (W.C. Cheng & Y.W. Law) L.K. Fu & Nan Li是大别山五针松Pinus dabeshanensis W.C. Cheng & Y.W. Law的异名；Pinus prominens Mast.以及Pinus tabuliformis var. densata (Mast.) Rehder是高山松Pinus densata Mast.的异名；Pinus funebris Kom.是长白松Pinus densiflora Siebold & Zucc.的异名；Pinus michoacana Martínez是德文松Pinus devoniana Lindl.的异名；Pinus durangensis form quinquefoliata Martínez是杜兰戈松Pinus durangensis Martínez的异名；Pinus kwangtungensis Chun ex. Tsiang、Pinus kwangtungensis var. varifolia Nan Li & Y.C. Zhong是海南五针松Pinus fenzeliana Hand.-Mazz.的异名；Pinus reflexa (Engelm.) Engelm.是反折五针松Pinus flexilis var. reflexa Engelm.的异名；Pinus maritima Aiton是阿勒颇松Pinus halepensis Mill.的异名；Pinus rudis Endl.以及Pinus wilsonii Roezl是灰叶山松Pinus hartwegii Lindl.的异名；Pinus leucodermis Antoine是波斯尼亚松Pinus heldreichii H. Christ的异名；Pinus massoniana var. henryi (Mast.) C.L. Wu、Pinus massoniana var. wulingensis C.J. Qi & Q.Z. Lin以及Pinus tabuliformis var. henryi (Mast.)

C.T. Kuan是巴山松Pinus henryi Mast.的异名；Pinus luchuensis var. hwangshanensis (W.Y. Hsai) C.L. Wu是黄山松Pinus hwangshanensis W.Y. Hsai的异名；Pinus ponderosa var. jeffreyi (A. Murray bis) Vasey是加州黄松Pinus jeffreyi A. Murray bis的异名；Pinus insularis Endl.、Pinus khasia Engelm.、Pinus khasya Royle ex Gord.以及Pinus khasyana Griff.是卡西松Pinus kesiya Royle ex. Gordon的异名；Pinus ikedae Yamam.是南亚松Pinus latteri Mason的异名；Pinus lawsonii var. gracilis Debreczy & I. Rácz是灰叶卵果松Pinus lawsonii Roezl ex. Gordon的异名；Pinus chihuahuana Engelm.是奇瓦瓦松Pinus leiophylla var. chihuahuana (Engelm.) Shaw的异名；Pinus crassicorticea Y.C. Zhong & K.X. Huang及Pinus sinensis D. Don是马尾松Pinus massoniana Lamb.的异名；Pinus argyi Lemée & H. Lév.、Pinus argyi var. longivaginans H. Lév.以及Pinus cavaleriei Lemée & H. Lév.是马尾松(原变种)Pinus massoniana var. massoniana的异名；Pinus armandii var. mastersiana (Hayata) Hayata是台湾果松Pinus mastersiana Hayata的异名；Pinus tenuifolia Benth.是薄叶松Pinus maximinoi H.E. Moore的异名；Pinus finlaysoniana Wall. ex. Blume是苏门答腊松Pinus merkusii Jungh. & de Vriese的异名；Pinus formosana Hayata及Pinus uyematsui Hayata是台湾五针松Pinus morrisonicola Hayata的异名；Pinus mugho Laichard.是欧洲山松(矮赤松)Pinus mugo Turra的异名；Pinus remorata H. Mason是糙果松Pinus muricata D. Don的异名；Pinus laricio Poir.、Pinus laricio var. corsicana Loudon以及Pinus nigra var. maritima (Aiton) Melville是南欧黑松(亚种)Pinus nigra subsp. laricio (Poir.) Maire的异名；Pinus austriaca Höss及Pinus nigra var. austriaca (Höss) Badoux是欧洲黑松(原亚种)Pinus nigra subsp. nigra的异名；Pinus pallasiana D. Don是克里米亚黑松Pinus nigra subsp. pallasiana (Lamb.) Holmboe的异名；Pinus salzmannii Dunal是西欧黑松(亚种)Pinus nigra subsp. salzmannii (Dunal) Franco的异名；Pinus pentaphylla var. himekomatsu (Miyabe & Kudô) Makino是日本五针松Pinus parviflora Siebold & Zucc.的异名；Pinus pentaphylla Mayr是北日本五针松(变种)Pinus parviflora var. pentaphylla (Mayr) A. Henry的异名；Pinus washoensis H. Mason & Stockw.是西黄松(原变种)Pinus ponderosa var. ponderosa的异名；Pinus brachyptera Engelm.是岩生西黄松(变种)Pinus ponderosa var. scopulorum Engelm.的异名；Pinus estevezii (Martínez) J.P. Perry是滑皮松Pinus pseudostrobus Lindl.的异名；Pinus apulcensis Lindl.及Pinus oaxacana Mirov是阿普尔科滑皮松Pinus pseudostrobus var. apulcensis (Lindl.) Shaw的异名；Pinus yecorensis Debreczy & I. Rácz及Pinus yecorensis var. sinaloensis Debreczy & I. Rácz是滑皮松(原变种)Pinus pseudostrobus var. pseudostrobus的异名；Pinus insignis Douglas ex. Loudon及Pinus tuberculata D. Don是辐射松Pinus radiata D. Don的异名；Pinus rigida var. rigida是刚松(英国短叶松)Pinus rigida Mill.的异名；Pinus longifolia Roxb. ex. Lamb.是西藏长叶松Pinus roxburghii Sarg的异名；Pinus rigida var. serotina (Michx.) Loudon ex. Hoopes是晚松Pinus serotina Michx.的异名；Pinus coronans Litv.及Pinus hingganensis H.J. Zhang是新疆五针松Pinus sibirica Du Tour的异名；Pinus ayacahuite var. brachyptera Shaw是奇瓦瓦五针松Pinus strobiformis Engelm.的异名；Pinus krylovii Serg. & Kondr.及Pinus mughus Jacq.是欧洲赤松Pinus sylvestris L.的异名；Pinus hamata (Steven) Sosn.及Pinus kochiana Klotzsch ex. K. Koch是钩刺松(变种) Pinus sylvestris var. hamata Steven的异名；Pinus densiflora var. ussuriensis Liou & Z. Wang ex. Mayr及Pinus ussuriensis (Liou & Z. Wang ex. Mayr) W.C. Cheng & Y.W. Law是樟子松(变种)Pinus sylvestris var. mongholica Litv.的异名；Pinus lapponica (Hartm.) Mayr、Pinus montana Hoffm.以及Pinus sylvestris var. turfosa Willk. ex. Woerl.是欧洲赤松(原变种)Pinus sylvestris var. sylvestris的异名；Pinus leucosperma Maxim.、Pinus takahasii Nakai、Pinus tabuliformis form jeholensis Liou & Z. Wang、Pinus tabuliformis form purpurea Liou & Z. Wang以及Pinus tabuliformis var. rubescens Uyeki是油松Pinus tabuliformis Carrière的异名；Pinus mukdensis Uyeki ex. Nakai是黑皮油松(变种)Pinus tabuliformis var. mukdensis (Uyeki ex. Nakai) Uyeki的异名；Pinus taihangshanensis Hu & T.T. Yao是油松(原变种)Pinus tabuliformis var. tabuliformis的异名；Pinus tabuliformis form umbraculifera (Liou & Z. Wang) Q.L. Wang是扫帚油松Pinus tabuliformis var. umbraculifera Liou & Z. Wang的异名；Pinus mugo subsp. uncinata (Ramond ex. DC.) Domin是山赤松Pinus uncinata Ramond ex. DC.的异名；Pinus mugo var. rotundata (Link) Hoopes及Pinus rotundata Link是山赤松 (原亚种)Pinus uncinata subsp. uncinata的异名；Pinus wangii var. kwangtungensis (Chun ex. Tsiang) Silba是华南毛枝五针松Pinus wangii subsp. kwangtungensis (Chun ex. Tsiang) Businsky的异名；Pinus densata var. pygmaea Hsueh ex. C.Y. Cheng, W.C. Cheng & L.K. Fu是地盘松Pinus yunnanensis var. pygmaea (Hsueh ex. C.Y. Cheng, W.C. Cheng & L.K. Fu) Hsueh的异名；Pinus yunnanensis var. tenuifolia W.C. Cheng & Y.W. Law是云南松(原变种)Pinus yunnanensis var. yunnanensis的异名。

有些名称实际上是松属以外的其它属的物种的异名，例如，Pinus griffithii (Hook.f.) Parl.是落叶松属的红杉Larix griffithii Hook. f.的异名；Pinus chinensis Voss是落叶松属的秦岭红杉Larix potaninii var. chinensis (Voss) L.K. Fu & Nan Li的异名或杉木属的软叶杉木Cunninghamia lanceolata (Lamb.) Hook.的异名；Pinus excelsa Lam.是云杉属的欧洲云杉Picea abies (L.) H. Karst.的异名；Pinus rubra (Du Roi) D. Don是云杉属红云杉Picea rubens Sarg.的异名；Pinus tsuga (Siebold & Zucc.) Antoine是铁杉属的日本铁杉Tsuga sieboldii (Siebold & Zucc.) Carrière的异名。

松属植物标本的257个名称中，存在异名的名称(97个)占37.74%。异名的混乱使用制约了科研和相关产业发展。51%以上的松属植物标本的采集日期为50年以前。华山松(2141份)、油松(2439份)以及马尾松(3456份)的标本份数最多。大于3份(含)标本的有132种/亚种/变种，小于3份标本的有28种/亚种/变种。目前的标本材料不足以支持研究松属全球物种的分子鉴定和系统发生关系。对21国40个植物标本馆的4500份标本的取样调查结果显示，50%以上的热带植物标本存在名称鉴定错误 [33] 。应该从全球视角思考存在的问题，寻求解决难题、提升工作效率的对策。如果将收集保存各科属植物的全球所有物种的标本作为预期目标或完成工作的标准，阶段性进展只能获得有局限的认识。只有把松属的全部物种(包括标本和活植物材料)放在一起，结合DNA等多种特征和技术进行比较分析，才能有效澄清异名混乱问题，揭示进化格局的全貌和实态，评估不同学派的物种概念(至少有26种物种概念)的合理性和价值，工作量仍然巨大 [34] - [36] 。

在全球公共数据库中，仍然存在未通过GenBank工作人员(专家)核准的叶绿体基因组序列数据或不完整的叶绿体基因组数据，例如，MK782762.1 (UNVERIFIED: Pinus kesiya var. langbianensis chloroplast sequence)、MT583787.1 (UNVERIFIED: Pinus armandii voucher Pa413 chloroplast sequence)、MT583779.1 (UNVERIFIED: Pinus armandii voucher Pa51 chloroplast sequence)、OP581022.1 (Pinus koraiensis chloroplast, partial genome)、FJ899563.2 (Pinus torreyana subsp. insularis chloroplast, partial genome)等。松属以外的其它植物科属中也存在类似的情况，例如，OR415832.1 (Camellia costata voucher YSX50954 chloroplast, partial genome)、ON491576.1 (UNVERIFIED: Camellia sinensis chloroplast, complete genome)、OK375437.1 (UNVERIFIED: Rosa rugosa chloroplast sequence)等。公共数据库中的叶绿体基因组序列数据的质量有待提升。植物各科属之间，叶绿体基因组序列变异较大。科学论文和数据不仅仅是一个科研团队在完成项目任务，数据本身可以从不同角度加以分析，具有应用于其它科学领域的潜力。经过其他独立研究团队验证的数据和结论才能成为加速科学发展的基石。应该通过公益性高级培训班和研修班机制，普及叶绿体基因组序列的精确组装方法和相关技术，促进对叶绿体基因组的深度理解。高质量数据生产体系的建设与维护应该是科学发展战略的重要组成部分之一。

叶绿体是植物细胞中的“能量工厂”，它们利用阳光、二氧化碳和水，进行光合作用，产生我们赖以生存的氧气和糖分。这个过程不仅仅是植物的生存方式，更是整个生态系统的基础。叶绿体基因组序列的构成组分的功能验证研究已进入新阶段 [37] - [39] ，例如，德国专家Ralph Bock教授的团队利用一种精巧的实验方法来探索质体(包括叶绿体、白色体和有色体)基因组中反向重复区(a large inverted repeat (IR) region)的功能重要性。他们删除了烟草Nicotiana tabacum叶绿体基因组中的反向重复区的一个完整的拷贝(长度为25.3-kb)，获得了拥有长度变短的质体基因组的烟草植株。实验结果显示，反向重复区具有强化质体翻译能力的功能。在叶绿体和非光合作用质体中，IR区的删除导致了烟草植株体内质体基因组数目显著增多。删除IR区序列、基因组长度随之变短之后，烟草植株的耐受性良好。删除IR区之后的烟草植株可以提供一种简化的质体基因组结构 [37] ，该方法在质体合成生物学和合成基因组学方面具有应用前景。利用质体基因组转化作为“分子农业”的工具，可用来大量生产有价值的蛋白质和代谢物质 [38] 。

科研项目实施过程中，通常会涌现出大量的思考半成品，经过补充，可以提升认识高度，发表论文。科研人员的大量半成品思考没有发表出来。应该创造多种机制，促进科研人员之间充分交流，开展多样化的互通有无式的协作，不仅有助于提升项目的完成质量，也可以促进项目审批方和项目执行者更加聚焦重大、关键科学难题，从而提高科研经费的利用效率，推动经济社会高速发展。长期以来，科普教育效果受到场地空间狭窄、展示内容篇幅有限、从业人员数量不足、学历不高、交通距离较远、参观期间时间较为仓促等不利条件的制约。大学优秀教科书内容，例如，植物科学概论、植物分类学概论、普通地质学等，如果能够在网上免费阅读，将促进科学教育和科普工作更加系统地提升到一个新的高度、广度和深度。全民总体科学认知水平的提升，有助于消除异名的混乱使用。分子检索表中揭示物种差异的、具有分类价值的单核苷酸多态位点的产生机制，可能与地质历史事件、自然环境变化以及基因组本身的遗传变异规律存在较复杂的关系，有待结合地质学、分子遗传学、化学和量子科学领域的最新进展和新技术深入研究。

我们的新方法对于松属植物资源遗传多样性的分类修订、保护和利用具有重要价值。建立松属全部物种的分子检索表，需要全球取样和国际协作。全球植物的物种数量众多，叶绿体基因组组装方法的公益性培训和普及有助于大规模产出更多的精确数据，加快全球植物生命之树的重建速度。科学文献包括优秀教科书的全球免费开放阅读(Open Access)是消除异名混乱使用现象的有效途径之一。从叶绿体基因组大数据中提取有物种分类价值的关键特征数据，在应用人工智能分析、管理和利用植物资源多样性方面可节省算力、提高效率。深入理解分子检索表中具有分类价值的单核苷酸多态位点的产生机制，是未来研究的重要方向之一。

天津市人力资源建设服务中心、上海计算技术培训中心、中国科学技术大学、包头钢铁职业技术学院、沈阳农业大学、中国科协科学技术创新部、中国标准化协会教育培训部、国家纳米科学中心、中国科学院微生物研究所、北方工业大学以及朱嘉老师和祖敏老师对本研究的推进予以热情支持。在本调查过程中，得到国家植物标本资源库(National Plant Specimen Resource Center)平台的支持。

国家自然科学基金项目(No. 31770744)。

^*通讯作者。