 Hans Journal of Biomed icine 生物医学, 2011, 1, 39-44 http://dx.doi.org/10.12677/hjbm.2011.12007 Published Online October 2011 (http://www.abtbus.com/journal/hjbm/) Copyright © 2011 Hanspub HJBM The Effect of the PD98059 on H2O2 Induced Apoptosis and Associated Proteins of Human Breast Cancer Cells Qianmei Zhou, Shibing Su* Research Center for Traditional Chinese Medicine Complexity System, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai Email: tazhou@163.com; shibingsu@yahoo.com Received: Sep. 17th, 2011; revised: Sep. 28th, 2011; accepted: Sep. 29th, 2011. Abstract: Objective: to study the effect of MEK inhibitor of PD98059 on apoptosis induced by H2O2 and its mechanisms in human breast cancer MCF-7 cells. Methods: H2O2 inducing apoptosis in MCF-7 cells was set to observe apoptosis and its associated proteins treated in the present or absent of PD98059. The cellular morphology was investigated by AO staining. Apoptosis ratio was analyzed by flow cytometry. The expres- sions of p53, PCNA, caspase-3, caspase-9 and Bcl-2 were observed using Western blot analysis. Results: apoptosis was observed with cells treated H2O2 for 4 or 12 h while the degree of apoptosis was greatly de- creased by 4% or 14% in MCF-7 cells treated with H2O2 and PD98059 together. There was significantly dif- ference between with the treatment of H2O2 and PD98059 in the presence of H2O2 for 12 h (P < 0.05). The increased p53, activated caspase-3 and caspase-9 and decreased Bcl-2 were appeared with H2O2 treatment. However, the levels of p53 and PCNA were downregulated, the extent of caspase-3 and caspase-9 activation was decreased, and the level of Bcl-2 was upregulated in MCF-7 cells treated with PD98059 in the presence of H2O2. Conclusions: MEK inhibitor of PD98059 inhibited apoptosis by downregulating the levels of p53 and PCNA, decreasing the activation of caspase-3 and caspase-9 and upregulating the level of Bcl-2 in MCF-7 cells. Keywords: PD98059; MEK; MCF-7; Apoptosis PD98059 对H2O2诱导的人乳腺癌细胞凋亡及 相关蛋白的影响 周钱梅，苏式兵* 上海中医药大学中医复杂系统研究中心，上海 Email: tazhou@163.com; shibingsu@yahoo.com 收稿日期：2011年9月17 日；修回日期：2011 年9月28 日；录用日期：2011 年9月29 日 摘 要：目的：探讨细胞外信号调节激酶的上游激酶(MEK)抑制剂 PD98059 对H2O2诱导的人乳腺癌 MCF-7 细胞凋亡的影响及其作用机制。方法：H2O2诱导乳腺癌 MCF-7细胞凋亡，PD98059 干预其细 胞凋亡。荧光染料吖啶橙(AO)观察细胞凋亡的形态学变化；流式细胞术法进行凋亡细胞计数；Western blot 法检测p53，PCNA，caspase-3、caspase-9 和Bcl-2的表达。结果：H2O2刺激细胞 4 h、12 h，明显 诱导了 MCF-7细胞凋亡。PD98059 将H2O2诱导的细胞凋亡率分别降低了约4％、14％，与 H2O2刺激 细胞 12 h 比较，具有显著的统计学差异(P < 0.05)。H2O2显著提高了 p53蛋白的表达，激活了 caspase-3 与caspase-9 蛋白，降低了 Bcl-2的表达，而 PD98059 逆转了 H2O2的刺激效应，下调了H2O2导致的 p53 与PCNA蛋白表达，降低了 caspase-3与caspase-9 蛋白活性，上调了Bcl-2蛋白表达。结论：MEK 抑制剂 PD98059 抑制了 H2O2诱导的 MCF-7细胞凋亡，其作用机制与其降低了 p53和PCNA蛋白表达 和caspase-3 与caspase-9 蛋白活性以及增加Bcl-2 蛋白表达有关。 关键词：PD98059；MEK；MCF-7；细胞凋亡  周钱梅 等 | PD98059对H2O2诱导的人乳腺癌细胞凋亡及相关蛋白的影响 Copyright © 2011 Hanspub HJBM 40 1. 引言 H2O2预处理细胞 2 h后换新鲜培养液，再加入终浓度 为80 μmol/L PD98059，分 别 于4 h、12 h 后收集细胞， 同时设同样条件下单独应用200 μmol/L H2O2、80 μmol/L PD98059 及未经药物处理的空白对照组。PBS 液洗涤 2遍，制成活细胞悬液，调整细胞浓度为1 × 106/ml，取 95 μl细胞悬液与 5 μl吖啶橙溶液(100 μg/ml) 混匀，吸 1滴混合液点于洁净玻片上，直接用盖玻片 封片，荧光显微镜观察，摄片。 丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白 激酶，其是信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要 传递者，参与多种细胞功能的调控，尤其是在细胞增 殖、分化与凋亡中，起着关键作用[1]。各种生长因子 及细胞因子的信号传递大多通过MAPK 信号通路来 进行[2,3]。细胞外信号调节激酶的上游激酶(MEK)是其 中重要的一环，具有酪、苏氨酸激酶活性，通过活化 其下游的细胞外信号调节激酶(ERK)，调节相关蛋白 的表达，影响细胞的增殖、分化及凋亡。本文拟运用 MEK 特异性抑制剂 PD98059 探讨其对人乳腺癌 MCF-7 细胞凋亡的影响，及其对相关蛋白的调节。 2.2.4. 流式细胞仪的检测 取对数生长期的人乳腺癌MCF-7 细胞，细胞处理 同2.2.3 中描述。适时观察，收集细胞，以不含EDTA 的0.25%的胰酶进行消化。冷PBS 洗细胞 2次。将细 胞转移至1.5 ml的离心管中。将对照组的细胞分为 4 管，每管中细胞浓度约1 × 106/ml。每管以400 l 1 × 结合缓冲液悬浮。其中，一管为空白对照、一管为 Annexin V 单染、一管为 PI单染、一管为 Annex in V 和PI 双染。染色法为加 5 l Annex in V-FITC，轻轻 振荡混匀，4℃避光染色 15 min。加 10 l PI 染液，混 匀，4℃避光染色5 min。药物处理过的细胞，以 400 l 1 × 结合缓冲液悬浮，再进行双染，上流式细胞仪进 行。具体实验操作按照 CELL LAB AposcreenTM Annexin V-FITC Apoptosis Kit试剂盒(BECKMAN COULTER)进行。 2. 材料与方法 2.1. 主要材料 MCF-7 细胞由中国科学院健康所荆清课题组惠 赠。PD98059 购自美国 Biomol 公司。H2O2购自美国 sigma 公司。RPMI 1640培养基购自美国 GIBCO 公司。 胎牛血清(FBS)购自美国 PAA公司。牛胰岛素(Insulin) 购自 Sigma 公司。p53(FL-393)、PCNA 抗体均购自美 国Santa Cruz公司。 2.2. 方法 2.2.5. Wester n免疫印迹 2.2.1. 溶液的配制 以少量二甲亚砜(DMSO)溶解 PD98059 粉末，配 制成 6.5 mg/ml 溶液(储存液)，分装置–20℃避光保存， 临用时稀释成所需浓度(DMSO终浓度 < 0.1%)。H2O2 以去离子水溶解，配制成10 mmol/L溶液(储存液)， 置4℃避光保存。 提取对照组和用药干预后的细胞总蛋白， Bradford 法定量后制备 western 上样样品，进行 SDS-PAGE 电泳。电泳后，剪取与凝胶大小一致的 PVDF 膜及滤纸，浸于Transfer buffer 中10 min，按下 列顺序放置于 Bio-Rad 半干电转移装置上：正极 滤纸 PVDF膜 凝胶 滤纸 负极，15 V 稳压转移30 min。5％脱脂奶粉室温封闭1 h，弃去封 闭液，加入一抗(用TBST 稀释)，4℃反应过夜。次日， 洗膜后加入二抗，室温反应1 h，洗膜后加入 ECL 显 色液，读片。 2.2.2. 细胞培养 MCF-7 细胞种植在RPMI 1640 培养基(含10% FBS，0.01 mg/ml Insulin，100 U/ml 青链霉素混合液， 20 mmol/LHEPES)中，细胞在 37℃ 5% CO2环境中单 层生长。 2.2.6. 统计学分析 2.2.3. 荧光染料吖啶橙(AO)的细胞形态学观察 实验结果数据以 x s 表示，两均数的比较用 ｔ 检 验，P < 0.05，表示具有显著的统计学意义。 取对数生长期的人乳腺癌 MCF-7 细胞，接种于 60 mm培养皿中。24 h后加入终浓度为200 μmol/L  周钱梅 等对诱导的人乳腺癌细胞凋亡及相关蛋白的影响41 | PD98059H2O2 3. 结果 3.1. H2O2及PD98059干预后细胞形态学变化及 其诱导的细胞凋亡率 AO 荧光染色对细胞凋亡的形态学观察实验结果 如图 1所示，正常细胞核结构正常、均呈绿色荧光(图 1(A))，200 μmol/L H2O2处理细胞 4 h、12 h 后，荧光 显微镜下观察到典型的细胞凋亡特征性变化，凋亡细 胞胞核呈固缩状的或半月形绿色荧光或橘黄色荧光 (图1(B，E))，与经 H2O2处理组比较，80 μmol/L PD98059 干预细胞 4 h、12 h 后，凋亡细胞减少。流式 细胞仪检测的细胞凋亡率如图2所示，H2O2刺激细胞 4 h、12 h，诱导的细胞凋亡率分别为19.59%、25.98%， 而PD98059将其凋亡率分别降低了约4%、14%，与 H2O2刺激细胞 12 h 比较，具有显著的统计学差异(P < 0.05)。 3.2. PD98059对p53、PCNA 蛋白表达的影响 对p53、PCNA蛋白的实验结果如图 3所示，与 未经 H2O2及PD98059 处理的对照组比较，200 μmol/L H2O2处理细胞 4 h、12 h后明显诱导了 p53蛋白的表 达，而 80 μmol/L PD98059 下调了经 H2O2刺激的 MCF-7 细胞中 p53 蛋白表达，PD98059 单独运用 12h 则完全抑制了 p53蛋白的表达。与未经 H2O2及 PD98059 处理的对照组比较，单独运用 PD98059 抑制 了PCNA 的表达，而其余各组均未明显变化。 3.3. PD98059对caspase-3，caspase-9及Bcl-2 蛋 白的影响 200 μmol/L H2O2刺激 MCF-7 细胞4 h、12 h 均激 活了 caspase-3 与caspase-9 的活性，降低了 Bcl-2 的表 达。80 μmol/L PD98059 降低了经 200 μmol/L H2O2刺 激下的 MCF-7细胞中 caspase-3与caspase-9的活性， 增加了该细胞中Bcl-2蛋白的表达。单独运用 PD98059 干预细胞12 h 则完全抑制了 caspase-3 与caspase-9 的 活性，增加了Bcl-2蛋白的表达(图4)。 4. 讨论 乳腺癌的发生发展涉及到一系列信号转导分子活 性的改变。研究表明，丝裂原活化蛋白激酶通路之一 的细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)/ 丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号传导途径在乳腺癌的发生 和发展中起着重要的作用。信号转导通路的异常活化 能够导致细胞丧失凋亡和分化的能力，促使细胞恶性 转化，异常增殖，产生肿瘤，并能进一步促进肿瘤细 胞的增殖[4]。从 H2O2介导细胞凋亡的机制来看，H2O2 主要损伤细胞的膜性结构，暴露出来的膜结构成份磷 脂酰丝氨酸(PS)[5]，是吞噬细胞识别和吞噬凋亡细胞 的靶点。因此 H2O2作为ROS 族被认为是诱导细胞凋 亡的重要因素，可作为细胞内信号转导分子参与细胞 凋亡的发生[6,7]。本研究探讨 MEK 特异性抑制剂 PD98059 对H2O2诱导的乳腺癌 MCF-7 细胞凋亡的影 响及其作用机理。 p53 是重要的肿瘤抑制因子，p53 通过参与细胞内 的信号转导通路，调节细胞的正常生命活动，包括细 胞周期，细胞增殖，细胞凋亡等[8]。p53 与细胞凋亡的 调控密切相关[9]，野生型 p53 的功能象“分子警察” 监控着细胞基因组的完整性，如果细胞DNA 受损， p53 基因产物累积，诱导细胞进入 G1 静止期，启动修 复系统进行修复。若修复失败，p53 基因产物可诱导 凋亡来触发细胞死亡。p53 蛋白作为转录因子，通过 阻止细胞复制和发动细胞凋亡——保持基因的稳定 性，维持细胞正常生长，抑制恶性增殖，对细胞生长 起负调节作用。 PCNA 是DNA 聚合酶的辅助蛋白，是细胞周期 所必需的物质，又称周期蛋白。PCNA在细胞增殖调 控上起着促进 DNA合成的重要作用，是评价细胞增 殖状态的客观指标[10]。研究表明[11]，正常乳腺组织中 PCNA 表达率较低，随不典型增生的加重表达率增高。 众所周知，野生型p53可抑制肿瘤的发生，而 p53 基 因突变或缺失与多种肿瘤的发生密切相关。当 p53基 因突变时，就失去了对细胞生长繁殖调控的功能，使 细胞通过 G1期进入S期，导致 PCNA 高表达。可见 p53蛋白的失活，对增殖细胞核抗原 PCNA 的调控作 用明显减弱，使其表达增强，乳腺癌细胞趋向于大量 增殖[12]。 本研究用200 μmol/L H2O2刺激细胞，诱导了细胞 凋亡，同时诱导了细胞中p53蛋白的表达，这与先前 的研究结果一致[13,14]。实验结果显示，H2O2刺激 Copyright © 2011 Hanspub HJBM  周钱梅 等 | PD98059对H2O2诱导的人乳腺癌细胞凋亡及相关蛋白的影响 Copyright © 2011 Hanspub HJBM 42 A B C D E F G Figure 1. The cellular morphology wa s in vestigated in MCF-7 cells treated both H2O2 and PD98059 alone or together for 4 and 12 h. (A) Treatment without both H2O2 and PD98059 (×400); (B) Treatment with H2O2 for 4 h (×400); (C) Treatment with H2O2 and PD98059 for 4 h (×400); (D) Treatm ent with PD98059 for 4 h (×400); (E) Treatment with H2O2 for 12 h (×400); (F) Treatment with H2O2 and PD98059 for 12 h (×400); (G) Treatment with PD98059 for 12 h(×400). Results are from 3 independent experiments 图1. PD98059对H2O2分别于 4 h、12 h刺激的 MCF-7 细胞中细胞形态学变化。(A) 未经 H2O2及PD98059 处理的对照组(×400); (B) H2O2 处理细胞 4 h(×400); (C) H2O2 + PD98059干预细胞 4 h(×400); (D) PD98059干预细胞 4 h(×400); (E) H 2O2处理细胞 12 h(×400); (F) H2O2 + PD98059 干预细胞 12 h(×400); (G) PD98059干预细胞 12 h(×400)。实验结果重复3次 Annexin-V PI FL1 FL1FL1 FL3 FL3 FL3 Untreated H 2 O 2 12h H 2 O 2 +PD98059 12h 10 4 10 4 10 3 10 3 10 2 10 2 10 1 10 1 10 0 10 4 10 3 10 2 10 1 10 0 10 4 10 3 10 2 10 1 10 0 10 0 10 4 10 3 10 2 10 1 10 0 10 4 10 3 10 2 10 1 10 0 01 01 01 02 0202 03 03 04 04 04 apoptosis(%) 30 25 15 10 5 0 20 12h4h H 2 O 2 PD98059 Figure 2. Apoptosis was observed in MCF- 7 cells treated with both H2O2 and PD98059 alone or together for 4 h and 12 h. *, P < 0.05， compared with H2O2 12 h. Values are means ± SE from 3 independent experiments 图2. PD98059对H2O2 分别于 4 h、12 h刺激的 MCF-7 细胞中细胞凋亡率的影响。*，P < 0.05，与H2O2刺激 MCF-7 细胞 12 h比较 。实 验数据以 ｘ ± ｓ 表示(n = 3) Figure 3. The levels of p53 and PCNA were observed in MCF-7 cells treated with both H2O2 and PD98059 alone or together for 4 h and 1 2 h . Results are from 3 independent experiments 图3. PD98059对H2O2分别于 4 h、12 h刺激的 MCF-7 细胞中 p53 和PCNA 蛋白的影响，实验结果重复 3次  周钱梅 等对诱导的人乳腺癌细胞凋亡及相关蛋白的影响43 | PD98059H2O2 H 2 O 2 Figure 4. Apoptosis related-proteins caspase-3, caspase-9 and Bcl-2 were observed in MCF-7 cells treated with both H2O2 and PD98059 alone or together for 4 h and 12 h. Results are from 3 independent experiments 图4. PD98059对H2O2分别于 4 h、12 h刺激的 MCF-7 细胞中凋亡相关蛋白 caspase-3、caspase-9 与Bcl-2的影响，实验结果重复 3次 MCF-7 细胞 4 h、12 h均可诱导细胞凋亡，且刺激了 MCF-7 细胞中p53的高表达，当其与PD98059 联合应 用时，下调了 p53 的表达。且当单独运用PD98059 时 p53 的表达被抑制的更明显，PD98059 干预细胞 12 h 时则完全抑制了MCF-7细胞中 p53 的表达。这可能与 H2O2的氧化应激反应诱导了 p53介导的细胞凋亡，而 PD98059 对其起到了抑制作用有关。同时，PD98059 干预细胞12 h 时下调了 PCNA 的表达，而其他各组均 未明显影响PCNA的表达，这可能与 PD98059 抑制细 胞增殖有关，其具体的作用机制有待进一步研究。 细胞凋亡从内外多因子复杂的相互作用诱导产生 凋亡信号，传递至 caspase 并使其活化开始，以蛋白 底物裂解、细胞解体为结局，从而使细胞凋亡得以完 成。线粒体释放的细胞色素C能与 Apaf-1 及caspase-9 形成一个复合体，在 dATP 、ATP 存在下活化 caspase-3、caspase-6、caspase-7 等成员，使凋亡进行 下去[15]。细胞凋亡受各种内外信号的影响调控，或抑 制或诱导细胞凋亡，Bcl-2 是凋亡研究中最受重视的癌 基因之一。有研究表明caspase-3 能裂解 Bcl-2 蛋白， 在体外从过表达 caspase-3的细胞中发现 Fas 配体诱导 细胞凋亡时，caspase 能在 Bcl-2蛋白环状区域的 Asp34 处裂解 Bcl-2 蛋白。 本研究发现，经H2O2刺激的MCF-7 激活了 caspase-3 与caspase-9 蛋白，下调了 Bcl-2的表达，而 PD98059 则降低了 H2O2的效应，即 PD98059 降低了 caspase-3 与caspase-9 的活性，提高了Bcl-2 蛋白的表 达。可见，H2O2通过 caspase-3、caspase-9 及Bcl-2途 径诱导的细胞凋亡被 PD98059 阻断。 5. 结论 综上所述，本研究证实了 H2O2可诱导细胞凋亡， 同时可刺激细胞中凋亡相关蛋白p53 的高表达，激活 caspase-3 与caspase-9 蛋白，降低 Bcl-2 水平。MEK 特异性抑制剂PD98059 则抑制了胞凋亡，同时抑制了 细胞中 p53 的表达，且其下调了细胞中 PCNA 的表达， 降低了 caspase-3 与caspase-9 的活性，提高了Bcl-2 蛋白的表达。提示在人乳腺癌 MCF-7 细胞中 p53、 PCNA 及其凋亡相关蛋白 caspase-3、caspase-9 与Bcl-2 的表达可能与MEK通路有关。 6. 致谢 感谢上海市教委 E-研究院中医内科建设计划资 助项目(E03008) 、上海市教委预算内科研项目 (2010JW28) 给予的资助。 参考文献 (References) [1] R. 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