耐辐射异常球菌osmC与ohr基因突变株的构建及功能研究 Construction and Functional Analysis of osmC Gene Disruptant and ohr Gene Disruptant in Deinococcus radiodurans R1

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Advance in Microbiology 微生物前沿, 2013, 2, 109-115

http://dx.doi.org/10.12677/amb.2013.24020 Published Online December 2013 (//www.abtbus.com/journal/amb.html)

Construction and Functional Analysis of osmC Gene

Disruptant and ohrGene Disruptant in

Deinococcus radiodurans R1*

Guangyan Cui 1,2 , Xianyi Xian 1,2 , Yingying Liu2, Qilin Dai1, Ming Chen2, Jin Wang2#

1 Life Science and Engineering College, SouthwestUniversity of Science and Technology, Mianyang

2 Biotechnology Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing

Email: 18749405362@126.com, # wangjin@caas.cn

Received: Nov. 28 th , 2013; revised: Dec. 12th, 2013; accepted: Dec. 18th, 2013

unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. In accordance of the Creative Commons

are guarded by law and by Hans as a guardian.

Abstract: The osmotic stress induced protein (OsmC) and organic hydroperoxide resistance protein (Ohr) were two

antioxidant enzymes which play an important role in bacteria defensing organic or inorganic peroxidation. The osmC

gene ( DR_1538) andohrgene (DR_1857) ofDeinococcus radiodurans(D. radioduransR1) encoded the two antioxi-

dant enzymes in the OsmC superfamily. Fusion PCR of three sections in vitroand linear transformation method were

used to firstly construct the spectinomycin-resistant mutant stain ( ΔosmC ) and the kanamycin-resistant mutant strain

( Δohr). TheΔ osmC ,Δohrmutants strain and wild-type strain were treated with CHP (cumene hydroperoxide), H2O2and

NaCl stress treatments. The result showed that ΔosmCmutant is extremely sensitive to H 2 O 2 compared with the wild

type, while Δohrmutant is more sensitive to CHP and the two mutant strains had no changes after NaCl stress.

QRT-PCR results displayed that the osmC gene of the wild-type strainwere up-regulated in both H 2O2and NaCl stress

treatments, and the osmCgene in H 2 O2stress levels was significantly upregulated. Theohrgenes in wild-type strain

after CHP and NaCl stress treatments upregulated approximately 2-folds. From above, it was presumed that there may

be different at the preference of two peroxidases in OsmC superfamily selecting substrates and the mode of those inter-

acting with their substrate; OsmC proteins may mainly use inorganic peroxide as its substrate and Ohr protein may be

primarily based on the organic peroxide as its substrate.

Keywords: D. radi o duransR1;osmCandohrGene; Mutant Stains; Antioxidant

耐辐射异常球菌 osmC 与 ohr 基因突变株的构建及功能研究*

崔广艳 1,2 ，鲜先毅1,2，刘盈盈2，代其林1，陈明2，王劲2#

1 西南科技大学生命科学与工程学院，绵阳

2 中国农业科学院生物技术研究所，北京

Email: 18749405362@126.com, # wangjin@caas.cn

收稿日期： 2013 年11月28日；修回日期： 2013 年12月12日；录用日期： 2013 年12月18日

摘要：渗透胁迫诱导蛋白 OsmC与有机氢过氧化物抗性蛋白Ohr都属于OsmC超家族抗氧化物酶，在细菌抵

御有机或无机过氧化反应的过程中起重要作用。耐辐射异常球菌 (D. radioduransR1)中osmC基因(DR_1538)与

ohr 基因( DR_1857)分别编码了OsmC超家族中的这两种抗氧化物酶。运用体外三段融合PCR方法和线性转化方

法，首次构建了壮观霉素抗性完全缺失突变株 ΔosmC和卡那霉素抗性完全缺失突变株Δohr

。

对 ΔosmC

、

Δ ohr

* 基金项目：973项目(2013CB733903)，863项目(2012AA063503)，国家转基因专项(2014ZX0801201B)，农业部公益性行业科研专项(201103007)

和西南科技大学博士研究基金 (11zx7104)。

# 通讯作者。

Open Access 109

耐辐射异常球菌 osmC 与 ohr基因突变株的构建及功能研究

Open Access

110

突变株

和野生型菌株分别都进行 CHP( 异丙苯基过氧化氢)、H2O2和NaCl胁迫处理，结果显示，与野生型相比，

Δ osmC 突变株对H2O2异常敏感，而 Δohr

突变株

对 CHP 更敏感，两个突变株对NaCl胁迫都没有大的变化。

QRT-PCR 结果显示在 H2O2和NaCl胁迫下野生型菌株中osmC基因都上调，其中H2O2胁迫下基因上调水平显

著；在 CHP 和 NaCl胁迫下野生型菌株中 ohr基因基因上调大约 2倍左右。根据结果推测同属于 OsmC超家族

的两个过氧化物酶选择底物的偏好性与作用方式可能并不一样， OsmC蛋白可能主要是以无机过氧化物作为底

物，而 Ohr 蛋白可能主要是以有机过氧化物为底物。

关键词：耐辐射异常球菌；osmC与ohr基因；突变株；抗氧化

1. 引言

耐辐射异常球菌 (Deinococcus radioduransR1,D.

radiodurans )是一种红色非致病性，能在极端环境下生

长的革兰氏阳性细菌，因其极强的抗电离和紫外线辐

射，抗干燥和活性氧化物而被众所周知 [1-3]。独特的抗

性机制使得耐辐射异常球菌成为完成基因组测序的

第一批生物体之一 [4] 。在氧化胁迫条件下，耐辐射异

常球菌自身的强抗氧化机制可以保护细胞免受氧化

损伤 [5] 。

一般来说，过氧化物是剧毒，会损害细胞内的大

分子物质。因此，过氧化物的消除对细菌的存活和增

殖来说非常重要 [6] 。其中过氧化物还原酶被认为在细

菌抵御有机或无机过氧化反应的过程中起重要作用。

AhpC ，Tpx， Ohr和OsmC是研究最多的4种过氧化

物还原酶。过氧化物还原酶中的有机过氧化物抗性蛋

白 (Ohr) ，渗透胁迫诱导蛋白 (OsmC) ，以及许多其他

未知的蛋白质都属于 OsmC超家族。每种酶的底物选

择，调节行为，生理学作用的不同主要取决于不同的

物种 [7] 。Gutierrez等人最初是在大肠杆菌中把OsmC

作为一个应对高渗环境所诱导的基因 [8] ，因此研究耐

辐射异常球菌中的 OsmC与Ohr两种过氧化物酶的功

能很有意义。

耐辐射异常球菌 (D. radioduransR1)中osmC基因

( DR_ 1538)与ohr基因(DR_1857)分别编码了OsmC与

Ohr 两种过氧化物酶。推测OsmC与Ohr可能在过氧

化条件或高渗条件下起作用，但目前对耐辐射异常球

菌中这两种抗氧化物酶的具体功能是否一致，这还不

清楚。因此，本研究利用体外三段融合 PCR方法和体

内重组技术构建了 osmC 基因的完全缺失突变株

Δ osmC与ohr 基因的完全缺失突变株Δohr。通过对野

生型菌株和 ΔosmC

、

Δ ohr

突变株

进行不同的胁迫

(CHP 、H2O2和NaCl)处理以及分析两个基因在不同胁

迫下的表达量，初步探索了 D. radioduransR1(DR)中

两种抗氧化物酶的生物学功能，为后续进行深入的体

外酶活实验奠定了基础。

2. 材料与方法

2.1. 材料

2.1.1. 菌株、质粒

本实验所用菌株和质粒如表 1 所示，大肠杆菌于

LB 培养基 (1% Typtone，0.5%Yeast extract，1% NaCl，

pH 7.0 ，121℃高压灭菌) 37℃培养，耐辐射异常球菌

于 TGY培养基(1% Typtone，0.5% Yeast extract，0.1%

glucose ， 112℃高压灭菌)30℃培养。

Table 1. Strains and plasmids of this research

表 1.实验所用菌株和质粒

Strains and plasmids characteristics Source

Deinococcus radiodurans R1 CGMCC 1.633 Store in this lab

Δ osmC ,

Δ ohr

osmC gene deleted-mutant

ohr gene deleted-mutant

This study

E. coli trans10

pKatAPH3

pKatAAD2

Competent strain

Km r

Spe r

TransGen Biotech

Store in this lab

pGEM-T Easy Amp r TaKaRa

耐辐射异常球菌 osmC 与 ohr基因突变株的构建及功能研究

2.1.2. 主要试剂

PrimeStar HS DNA Polymerase 、ExTaq酶、dNTPs

购自 TaKaRa 公司；DNA marker、细菌基因组DNA

提取试剂盒、普通 DNA 纯化试剂盒、质粒小量提取

试剂盒、琼脂糖凝胶回收 DNA 试剂盒均购自北京天

根生化公司；限制性内切酶购自 NEB 公司；RNA提

取试剂盒购自 Promega公司；实时定量荧光PCR试

剂盒 SYBR®Premix Ex Taq™购自TaKaRa公司；化学

试剂均为分析纯。

2.2. 突变株 ΔosmC、Δohr的构建

利用 Primer Premier 5.0和DNAMAN软件设计

PCR 引物。分别以耐辐射异常球菌基因组中的osmC

( DR_1538) 基因、 ohr基因( DR_1857)以及各自基因上

下游序列 ( 向上向下各延伸800 bp)为模板设计待融合

的上下游片段的 PCR引物，再分别设计以 pKatAAD2 、

pKatAPH3 载体序列为模板的抗性盒片段PCR引物，

引物序列如表 2 所示。

以突变株 Δ osmC的构建为例，用引物 1538-U-

F/R 、1538-D-F/R分别扩增DR_1538基因的上下游同

源臂 (524 bp 和 498 bp) ，引物 1538-S-F/R 扩增壮观霉

素抗性盒基因的反向互补序列 (942 bp)。以切胶回收的

三个待融合的片段为模板，各片段之间的互补序列为

引物，进行两步法融合 PCR 反应[9]。PCR反应第一步

反应程序为 95 ℃3 min；95℃15 s，60℃20 s，72

℃ 6 min，11 cycles；72℃10 min，第二步PCR反应

程序为 95 ℃10 min；95℃30 s，54℃20 s，72℃1

min ， 35 cycles；72 ℃ 10 min。融合片段长度为1888

bp 。PCR扩增所用的聚合酶均为PrimeStar HS DNA

Polymerase 。

回收的融合片段需加 A(72 ℃10 min)再与pGEM-

T Easy 载体16℃连接过夜。利用热激法将获得重组载

Table 2. Primers for fragments amplification

表 2.目的片段扩增所用的引物

引物引物序列 (5’-3’)

1538-U-F GGGCGAGTGCCTTGGTGA

1538-U-R CCAAGGTAGTCGGCAAATAAGTGTGCTCGCTGCGGGGC

1538-S-F GCCCCGCAGCGAGCACACTTATTTGCCGACTACCTTGG

1538-S-R TCAGCCTTCGAGAATCGCTTCGAGCTCGCATGGAGACC

1538- D-F GGTCTCCATGCGAGCTCGAAGCGATTCTCGAAGGCTGA

1538- D-R GGCACATGCTTGACCCTGACC

1857-U-F CGCTCCCACACCCAGAATCAC

1857-U-R GTTTTTCTAATCAGGATCCTCTAGGCGGTTGCTTCGGCGGTAT

1857-K-F ATACCGCCGAAGCAACCGCCTAGAGGATCCTGATTAGAAAAAC

1857-K-R GTGATGGTGGAGTCGGCGACGGTATCGATAAGCTTGATAT

1857-D-F ATATCAAGCTTATCGATACCGTCGCCGACTCCACCATCAC

1857-D-R CGCATTCTTCTGGGCACCTAC

1538-I-YZ-F AGCGCAGTACTCGTTCAAGA

1538-I-YZ-R GTCGAGCGCCTTGATCTCAT

1538-O-YZ-F TGCCGTGGTAGATGTTTTCGTC

1538-O-YZ-R TGGGGACAAAGCAGGCAC

1857-I-YZ-F AGTGACGACCGCCTCAACCT

1857-I-YZ-R CCAGCGCACCCTGAAAGC

1857-O-YZ-F CAGTGACGACCGCCTCAACCT

1857-O-YZ-R CCAGCGCACCCTGAAAGC

Open Access 111

耐辐射异常球菌 osmC 与 ohr基因突变株的构建及功能研究

体转入 trans10 感受态中，利用蓝白斑和氨苄抗性筛

选单克隆。单克隆经测序验证正确后，提取质粒，用

限制性内切酶 NcoI/PstI双酶切，得到的酶切片段通过

同源重组方法转进 DR中，用高浓度的壮观霉素 Spc

(20 mg/mL) 筛选完全缺失突变株。挑取的单克隆子的

基因组经 1538-I-YZ-F/R引物来验证 DR_1538内部缺

失的基因 (165 bp) 是否存在突变株中。经1538-O-YZ-

F/R 引物来验证融合片段同源重组部位的正确性。

突变株 Δohr的构建与突变株 ΔosmC的构建方法

类似，其中卡纳霉素抗性盒反向插入取代了 ohr 基因，

ohr 基因上下游同源臂与抗性盒的融合片段大小为

2104 bp 。突变株用 20 μ g/mL Km筛选，筛选的单克隆

子基因组用 1857-I-YZ-F/R 与 1857-O-YZ-F/R引物分

别验证突变株中 DR_1857 基因缺失和重组的情况。

2.3. CHP( 异丙苯基过氧化氢 )处理

从培养平板上分别挑取野生型菌株 DR 和 ΔosmC、

Δ ohr

突变株

的单克隆子转接于 50 mL TGY液体培养

基 ( 含抗生素 ) 中，30℃培养至OD600约为0.6，每个菌

株的 50 mLTGY液体菌液分装成5个10 mL的菌体，

分别加入不同体积的 CHP ，使终浓度为0 mM、1 mM、

2 mM 、3 mM和5 mM，30℃摇床温育0.5 h，取处理

后的 100 μL菌液用PBS(磷酸钾缓冲液)倍比稀释，每

个稀释度各取 8μL点在 TGY 固体培养基上，30℃培

养 2~3 d，观察菌落生长情况。

2.4. H 2O2处理

从培养基平板上分别挑取野生型菌株 DR 和

Δ osmC 、Δ ohr

突变株

的单克隆转接于 20 mL TGY液

体培养基 (含抗生素 )中，30℃培养至OD600约为0.6，

分别取 1 mL 菌体，离心收集，分别加1 mL PBS(磷酸

钾缓冲液 ) 重悬，加入不同体积的H2O2，使终浓度为

0 mM 、20 mM、40 mM、60 mM、80 mM，黑暗环境

室温静置 0.5 h，取处理后的 100μL菌液用 PBS(磷酸

钾缓冲液 ) 倍比稀释，每个稀释度各取8μL点在TGY

固体培养基平板上， 30 ℃培养2~3 d，观察菌落生长

情况 [10] 。

2.5. NaCl 处理

从培养基平板上分别挑取野生型菌株 DR 和

Δ osmC 、Δ ohr

突变株

的单克隆转接于 20 mL TGY液

体培养基 (含抗生素 )中，30℃培养至OD600约为0.6，

分别取 1 mL菌体，离心收集菌体，菌体分别用 1 mL

2 M 和3 M NaCl重悬，30℃摇床温育4 h，处理后的

菌液用 PBS(磷酸钾缓冲液)倍比稀释，每个稀释度各

取 8μL点在TGY固体培养基平板上，30℃培养2~3 d，

观察菌落生长情况。

2.6. 不同胁迫下osmC基因、 ohr基因的

表达分析

从培养基平板上挑取野生型菌株 DR，转接于 4

瓶 20 mL TGY液体培养基中，分别用上述的胁迫处理

方法进行 2 mM CHP 、80 mM H2O2和2 M NaCl处理，

以未处理的野生型菌株做对照。大量收集菌体，提取

RNA ，以反转录得到的cDNA为模板，通过QRT-PCR

分析 osmC 基因在H2O2和NaCl胁迫处理下的表达情

况与 ohr 基因在CHP和NaCl胁迫处理下的诱导表达

情况。

3. 结果与分析

3.1. osmC基因、ohr基因序列结构域特征与

突变株的构建

不同细菌中 OsmC与Ohr蛋白的同源性分析表

示，它们是两组相关的蛋白 [11]。OsmC与Ohr亚家族

成员存在于革兰氏阳性和革兰阴性菌中，并且与其他

的原核或真核蛋白质没有显著的序列同源性 [12]。从

NCBI 基因库获得Deinococcus radiodurans R1(耐辐射

异常球菌 )、 Pseudo monas aeruginosa(铜绿假单胞菌)、

Xanthomonas campestris (油菜黄单胞菌)中osmC与ohr

基因的序列，通过 DNAMAN软件将基因序列翻译成

氨基酸进行同源序列比对 ( 图1)。OsmC与Ohr亚家族

蛋白各自的同源性在 40%~60% 之间，两个亚家族之

间只有约 20%的同源性。鉴于半胱氨酸残基 Çys已被

证明是 AhpC 过氧化物酶代谢有机过氧化氢的活性位

点 [13] ，OsmC与Ohr亚家族共有的比较保守的羧基末

端的两个不变的半胱氨酸残基对于清除过氧化氢发

挥关键性作用。 OsmC与Ohr亚家族之间不同之处在

于第二个半胱氨酸残基相邻的氨基酸序列， Ohr亚家

族中第二个半胱氨酸 (Cys125)相邻的氨基酸序列包含

了一个 VCPY 基序，而OsmC亚家族中并不含有(图

Open Access

1 12

耐辐射异常球菌 osmC 与 ohr基因突变株的构建及功能研究

注：黄色框表示保守的半胱氨酸，红色框表示 VCPY 基序；DR:Deinococcus radioduransR1; PA:Pseudomonas aeruginosaPAO1; XC:Xanthomonas

campestris pv. campestris str. ATCC 33913。

Figure 1. Amino acid sequence alignments of OsmC and Ohr

图 1. OsmC与Ohr蛋白的氨基酸序列比对

1) 。VCPY基序使半胱氨酸处于异常亲核性的环境中，

导致半胱氨酸对活性氧高度敏感 [13]。OsmC与Ohr亚

家族之间结构的差异可能导致两个亚家族的功能不

一样。

通过 PCR方法验证 ΔosmC突变株的构建是否成

功，以突变株的基因组为模板，野生型 DR 基因组做

为阳性对照，用 1538-I-YZ-F/R 、1538-O-YZ-F/R两对

引物分别验证 osmC 基因与融合片段的大小。PCR扩

增结果显示阳性对照中 1538-I-YZ-F/R引物扩增出

165 bp 大小的片段，突变株中不存在该片段，表明

Δ osmC 已完全缺失osmC；1538-O-YZ-F/R引物在阳

性对照中扩增出 1542 bp ，在突变株中扩增的片段为

2018 bp ，表明壮观霉素抗性盒已成功替换DR_1538

基因。

同理用 1857-I-YZ-F/R 与 1857-O-YZ-F/R引物验

证 Δohr突变株，阳性对照为野生型DR基因组。结果

显示，阳性对照中1857-I-YZ-F/R扩增片段大小为124

bp ，突变株中未扩增出目的条带，表明Δohr中不包

含 ohr基因。以野生型DR基因组为模板，1857-O-YZ-

F/R 扩增出包含DR_1857 基因上下游序列的对照片段

(1942 bp) ，以突变株基因组为模板，扩增的条带大小

为 2723 bp ，表明卡那霉素抗性盒成功替换DR_1857

基因，获得 Δohr

突变株

。

3.2. DR 与ΔosmC、Δohr突变株在不同胁迫处理

下的反应

耐辐射异常球菌 OsmC和Ohr分属于两个亚家

族，它们起着截然不同的或者交叉的功能值得我们去

研究。本实验首先就 DR 与ΔosmC、Δohr

突变株

三株

菌对有机过氧化物 CHP 的耐受性进行了研究：未处

理的三株菌长势一样， 1 mM CHP处理1 h后，三株

菌的长势减弱，但三株菌之间长势近似一样， 2 mM

CHP 处理 1 h后，ΔosmC突变株与DR长势近似一样，

而 Δohr突变株对2 mM CHP的敏感性比DR明显的

提高 ( 图 2) 。结果表明 Ohr 在消除有机过氧化物的过

程中起着重要作用。运用不同浓度的 H2O2处理三株

菌时发现，与 DR 相比，ΔosmC突变株在40 mM H2O2

处理时表现出对 H2O2更敏感，随着H2O2浓度的加大，

敏感性增强， 80 mM H2O2处理三株菌的结果如图2

所示，而 Δohr 突变株对H2O2 处理表现出与DR一样

的长势，结果表明 OsmC 在清除无机过氧化物的过程

中起着显著的作用。不同浓度的 NaCl 溶液对三株菌

处理不同时间的结果并不明显，三株菌的长势与未处

理比明显下降 ( 图3)，但三株菌之间无大的差异，推测

Open Access 113

耐辐射异常球菌 osmC 与 ohr基因突变株的构建及功能研究

2 3 4

2018 bp

1542 bp

165 bp

2723 bp

1942 bp

124 bp

M: Tr ans 2KMarker; 1,3,5,7,8: 1538-O-YZ-F/R、1538-I-YZ-F/R、1857-O-YZ-

F/R 、1857-I-YZ-F/R引物的阳性对照；2, 4: 1538-O-YZ-F/R、1538-I-YZ-F/R

引物扩增 ΔosmC突变株；6, 9：1857-O-YZ-F/R、1857-I-YZ-F/R引物验证Δohr

突变株。

Figure 2. PCR assay of the mutant strains of ΔosmCandΔohr

图 2.ΔosmC和Δohr突变株的PCR验证

OsmC 和Ohr 在高渗条件(NaCl)下可能不起作用。

3.3. 不同胁迫处理对 osmC与ohr基因转录水平

的影响

我们使用实时定量 PCR技术去探索 DR野生型菌

株中 osmC 与 ohr

基因

在渗透胁迫 (NaCl)和氧化胁迫

(H 2 O2或CHP)下在转录水平的表达量。图4(a)中的结

果显示 osmC基因在无机氧化胁迫(80 mMH2O2)下相

对表达量上升了约 8.9倍，表明 osmC基因受到 H2O2

的显著诱导，而它在渗透胁迫 (2 M NaCl)下相对表达

量上升了约 2倍，推测osmC基因可能受到渗透胁迫

诱导。 ohr

基因

的相对表达量在有机氧化胁迫 CHP和

NaCl 条件下都上升了 2倍左右，推测ohr

基因

可能受

到两者的诱导。

4. 讨论

通常情况下，氧分子是稳定的，但是氧分子还原

时会产生有毒的活性氧 (ROS)[14] 。所有的ROS会氧化

胞内的大分子，包括 DNA和脂质。 ROS 解毒酶构成

了细菌氧化胁迫抵御系统中的主要成分。参与 ROS

清除中最主要的一种酶是过氧化氢酶。很多细菌有两

种类型的过氧化氢酶，分别为单官能团的过氧化氢酶

和双官能团的过氧化氢酶 /过氧化物酶。这两种酶对维

持细菌应对 H2O2 的能力非常重要。OsmC和Ohr是过

氧化物还原酶中研究的比较多的两种亚家族蛋白，但

每种酶在不同的物种中的存在形式、底物选择、所受

调控方式并不一样。一些细菌中只存在 OsmC 或Ohr

中的一种，例如 M. pneumoniae(肺炎支原体)，Vcho-

lerae ( 霍乱弧菌)与 X. fastidiosa(苛养木杆菌)中只有

Ohr 同源物，而E. coli中只有OsmC同源物。有一些

菌中 OsmC和Ohr都不存在，例如H.pylori(幽门螺

注：菌落图是取自每个处理的稀释梯度 (10−1、 10−2、 10−3、 10−4、 10−5)点状涂板培养而成。

Figure 3. Effects of various stress (2 mM CHP, 80 mM H 2O2, 3 M NaCl) on growth ofΔosmC,Δohrand DR strains

图 3.不同胁迫处理(2 mM CHP, 80 mM H2O2, 3 M NaCl)对DR和ΔosmC、Δohr菌株的影响

CK80mM H2O22M Nacl

Osmc 的相对表达量（Relative

expression levels of Osmc）

Osmc

osmC

osm

ohr

CK 2 mM CHP 2 M Nacl

ohr 的相对表达量

(relative expression levels of ohr)

(a) (b)

Figure 4. (a) Relative expression levels of osmCin different stress; (b) Relative expression levels ofohrin different stresses

图 4. (a) 不同胁迫条件下osmC基因的相对表达水平；(b)不同胁迫条件下ohr基因的相对表达水平

Open Access

1 14

耐辐射异常球菌 osmC 与 ohr基因突变株的构建及功能研究

杆菌 )， M. tuberculosis(结核分支杆菌)，N. meningiti-

dis (脑膜炎双球菌)等细菌[15]。耐辐射异常球菌中存在

OsmC 与 Ohr两种酶，但它们的具体作用功能并不清

楚。

本研究成功构建了耐辐射异常球菌中 osmC与

ohr 基因的缺失突变株，其中突变株ΔosmC对H2O2

胁迫处理比对有机过氧化物 CHP 胁迫处理更敏感，

而 Δohr突变株对有机过氧化物CHP处理更敏感，表

明 DR中的OsmC与 Ohr在底物选择偏好性上并不一

样。 DR 中 OsmC 过氧化物酶更偏好选择无机过氧化

物，而 Ohr 更偏好选择有机过氧化物。

与耐辐射异常球菌不同的是 E. coli中的 OsmC与

嗜热细菌中的 Ohr功能类似，都能利用H2O2与有机

过氧化物作为底物，但OsmC更偏爱有机过氧化物[16,

17] 。而Atichartpongkul等人提出假单胞绿脓杆菌osmC

基因的突变体对渗透胁迫的敏感性增加，包括高盐和

乙醇，表明假单胞绿脓杆菌中 Ohr 和OsmC具有有截

然不同的功能 [15] 。以E.coli中的OsmC与嗜热细菌中

的 Ohr的晶体结构作对比，OsmC与Ohr结构的不同

主要在活性位点上， Lesniak等人就推测活性位点的不

同导致了这两种酶在体内选择底物的喜好不同 [16-18] 。

而这个推测需要下一步对耐辐射异常球菌中的 OsmC

与 Ohr两种蛋白进行体外酶活测定与X-衍射获得的

晶体结构进行验证。本研究结果不但丰富了细菌中

OsmC 与 Ohr蛋白的作用机制，也为耐辐射异常球菌

中这两种酶的工业化生产意义奠定理论依据。

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